Электрофорезийн арга

Электрофорезийн хөгжлийн түүх

   1930 онд гель электрофорезд сахарозыг анх ашигласан.

   1955 онд цардуулыг ашигласан нь үр дүн муутай байсан.

 1959 онд Раймонд, Винстрауб нар анх удаа акриламид гелийг нүхний хэмжээ, тогтворжилт гэх мэт үзүүлэлтүүдийн нарийн хяналттайгаар ашигласан.

   1964 онд Орнштейн, Дэвис нар диск гель электрофорезийн аргыг хэрэглэсэн.

 1969 онд Вебер, Осборн нар уургийн дэд хэсгийн SDS ялгалтанд тусгайлан денатурацлагч агентийг ашигласан.

   1970 онд Leimmli-T4 фаг 28 бүрэлдэхүүн ялгасан. ‘SDS+багц гель’

   1975 онд 2 хэмжээст гелийн изоэлектрик фокус, SDS гель электрофорез гарсан

   1977 онд Секвуэнсинг гель

   1983 онд хөдөлгөөнт талбайн гель электрофорез

   1983 онд хялгасан хоолойн электрофорезийг тус тус танилцуулсан

Өнөөгийн эсийн биологийн лабораторид бодисыг салгах биотехнологийн гол техник нь электрофорез болон түүний хэлбэрүүд болоод байна. Энэ нь хямд, хялбар, үр дүнтэй, хүчтэй техник тул өргөн хэрэглэгдэж байна. Электрофорезийг 1 хэмжээст, 2 хэмжээст гэж ангилж болно. 1 хэмжээст электрофорез нь нуклейн хүчил болон рутин уураг ялгахад хэрэглэгддэг. 2 хэмжээст уургийн ялгалт нь эсэд байх бүх уургийг цэврээр ялгаж болно.

Электрофорезийн процесс:

Электрофорезд 2 төрлийн багаж шаардлагатай.

1. Тэжээлээр хангагч (цахилгаан үүсгүүр)

2. Буферийн  нөөцлүүр систем

Энэ систем нь гелийг суспензлэхийн тулд бага болон их буфер нөөцлүүрээс бүрдэнэ. Зөвхөн нөөцлүүр хоорондын цахилгаан холбоогоор гель дамжина. Нөөцлүүр бүрд цагаан алтан (Pl) электрод байрласан байна.

Дээжийн нягтыг өсгөхийн тулд макромолекулын дээжийг буфер агуулсан глицеролд уусгадаг байна. Электрофорезд pH=9 голдуу ашиглагддаг. Ийм нөхцөлд ихэнх уургууд сөргөөр цэнэглэгдэнэ. Иймд анод бага нөөцлүүрт байрлана. Дээжин дэх уургийг будах зорилгоор хөх өнгөтэй бромфенол оруулдаг. Бромфенол нь ямарч макромолекулаас хурдан шилжин хөдөлдөг байна.

Катодоос анод руу нэвтрэх гүйдлийг усны электролизийн урвал анод дээр хүчилтөрөгч, катод дээр устөрөгч үүсгэн явуулна.

Катодын урвал: 2e+2H₂O=2OH+H₂    HA+OH=A+H2O

Анодын урвал: H₂O=2H+1/2O₂+2e     H+A=HA

Системээр урсах электроны моль бүрд катод дээр 1 моль гидроксил ион, анод дээр 1 моль протон үүсдэг.

Электрофорезийн хэлбэрүүд

Бага хүчдэл бүхий нимгэн үеийн электрофорез:

Дэмжих орчин нь цаас, целлюлоз ацетат эсвэл цахиурын нимгэн үе байж болно.

Цаасны электрофорез. 

Энэхүү электрофорезийн аргад хромотографын цаас тохиромжтой. Бага хүчдэлийн цаасан электрофорез нь амин хүчил, пептид, уураг, нуклеотид, нуклейн хүчил, болон цэнэглэгдсэн карбогидрат шиг цэнэгтэй нэгдлийг хэмжээгээр ялгахад ашиглагддаг. Цаасан дээр бага хүчдэлт электрофорезийн үед жижиг молекулын диффуз нэлээд тохиолддог ба молекулын диффуз бага тохиолдох болон салгахад шаардагдах хугацаа буурсан үед өндөр хүчдэл ашигласнаар ялгарал нь илүү сайн харагдаж болох юм.

Ацетат целлюлоз. Иммунодиффуз болон иммуноэлектрофорез шиг микротехникт зориулагдсан ба долгионоор тодорхойлогддог бодисуудын ялгахад илүү тохиромжтой. Энэ нь ерөнхийдөө цаасан электрофорез шиг холимгийг ижил хэмжээгээр салгадаг. Гэхдээ клиник оношлогоонд гемоглобин, липопротейн, гликопротейн, агуулсан цусны уургийг салгахад тусгайлан ашигладаг.

Нимгэн үеийн электрофорез. (TLE) Целлюлоз, хөнгөн цагаан,  цахиурын нимгэн үеийг шилэн аяганд нимгэн үеийн хромотограф (TLC) шиг бэлддэг. Энэ аягаа электрофорезийн нэгжид хөндлөн байрлуулдаг ба нөөцлүүрээс нэвчих замаар буфер шингээх боломжийг нимгэн үе олгоно.

TLE нь TLC шиг түргэн ба өндөр мэдрэмжтэй сайн ялгарал өгнө. TLE-д өндөр хүчдэл бас ашиглаж болно.

Гель электрофорез:

Гелийг агар, цардуул, полиакриламидаар бэлддэг. Хагас хатуу гелийн молекул шүүх шинж чанар нь уураг шиг том ионт нэгдлийг салгахад тусална. Жижиг молекулууд нь зөвхөн Сефадекс хэлбэрийн гелиэр шүүгдэнэ.

Цардуул гель: Тохирсон буферт цардуулын холимгийг халаах хөргөх замаар бэлдэнэ. Энэ нь хагас хатуу хэлбэртэй, мушгирсан цардуулын амилопектиний салбар гинжнээс шалтгаална.

Агароз гель нь агароз, агаропектин гэдэг ­­­­­­­2 галактозсуурьтай полимерээс тогтоно.

Акриламид гелийн бүрдэл

Акриламидаар макромолекулын шилжих нь гелийн бүтцээс хамаарна.

Полимер матриксыг бүтээхэд акриламид, N,N’-метилен биз (акриламид), тетраметилендиамин (TEMED) болон аммонийн персульфат орно.

Акриламид аммоний персульфатийн чөлөөт радикалыг хадгалдаг бөгөөд үүнийг идэвхжсэн акриламид гэнэ. Идэвхжсэн акриламид нь полимер гинж үүсгэх дараалсан акриламидын молекултай урвалд орно. Гель болохын тулд N,N’ метилен бизтэй акриламид хөндлөн холбогдох хэрэгтэй. TEMED эсвэл В-пропионитрилийг чөлөөт радикал хэлбэрт байлгах чадвартай тул голдуу гель хэлбэржихэд катализаторын зорилгоор 0.4% концентрацитай нэмдэг.

Гельд нүхний хэмжээ 2 үзүүлэлтээр тодорхойлогддог:

• Хөндлөн холбооны зэрэг
• Ашиглагдсан акриламидын тоо

Нийт акриламидын 5% нь N,N’-метилен-биз(акриламид) байхад нүхний дундаж хэмжээ хамгийн бага байна. Иймээс олонх нэгдэлд биз(акриламид)-н найрлага нийт акриламидын 5% байдаг, өөрчлөгддөггүй. Лабораторид  бид 30%-н акрил 0.8 % биз ашигладаг. Энэ нүхний хэмжээ акриламидын нийт найрлага өөрчлөгдсөнөөр зохицуулагдана.

Полиакриламидын гель үүсгэхэд дараах зүйлс шаардагдана.

Буфер нь акриламид гель ба нөөцлүүрт рН-ийг тогтмол барих болон цахилгаан орны дагуу гүйдэлтэй дамжуулах электролит шиг үйлчилгээтэй.

Буфер нь ялгаж байгаа макромолекултай харилцан үйлчилдэггүй байхаар сонгогдсон байна. Ийм харилцан үйлчлэл нь молекулын миграцын зэргийг өөрчилж болно. Хэрвээ макромолекулын саармагжих юмуу харилцан үйлчлэл нэмэгдвэл молекулын миграцын зэргийг өөрчлөх болно.

Орчны рН нь молекулыг денатурацлахгүй, цэнэглэж болохоор байх ёстой. Уургийн хувьд голдуу 4.5-9.0 байх ёстой. Гэхдээ өргөн эсвэл тодорхой утга шаардлагатай байж болно.

Буферийн ионы хүч ба концентрацийг тооцсон байх ёстой. Хэрвээ акриламид гель дэх электроний концентраци хэтэрхий бага байвал миграцилж байгаа молекул их хэмжээний гүйдэлтэй холбогдоно. Ингэснээр тэдгээр нь тод тууз (band) үүсгэхгүй. Гэхдээ нэвчих зона руу нэлээд тархдаг. Иймд энэ аргын ялгалт нь нэлээд буурдаг. Эсрэгээр гелийн электролитийн концентраци их өндөр байвал хүчдэл буурах үед гүйдлийн хэмжээ ихэссэн байдалтай байна. Энэ нь голдуу макромолекулын миграцийн зэрэг буурахад болон ялгаж байгаа уургийг денатурацид оруулах дулааны үед ийм үр дүн үзүүлнэ.

Гель рүү шилжих макромолекулын тоо хэмжээ нь молекулын хэмжээ болон түүний шууд дамжих нүхний дундаж хэмжээ  2-с хамаарна. Энэ шүүлт нь акриламид гелиэс олж авах ялгалтыг нэмэгдүүлнэ. Нийт гелийн концентраци ихсэх үед уургийн бүлгийн бодит хөдөлгөөний логарифм нь шугаман хамааралтай буурна.

Тасалдсан гель электрофорез

Диск рН эсвэл диск электрофорез нь дээр тодорхойлогдсон электрофорезоос ялгаатай. Үүнд:

1.     2 гелийн систем ашигладаг

2.    Буфер нөөцлүүрт болон гелийн матрикст ганцхан буфертэй системүүд ашиглана.

Бага ялгагч (lower separating) эсвэл урсах гелиэ зона электрофорезийн туршилттай ижил (5-10%) акриламидыг ашиглаж бэлддэг байна. Гельд ашиглагдсан буфер нь голдуу HCl-ийг ашиглаж рН утгыг тохируулдаг Tris шиг амин (pH=8.8) байна.

Ялгагч гелийг полимержсэний дараа түүний дээд талд гелийн үе полимерждэг байна. Энэ нь царцмаг гель байна. Нийт акриламидын найрлага ерөнхийдөө 2-3 % байна. Царцмаг гельд ашигладаг буфер нь Tris шиг амин байна. Гэхдээ энэ тохиолдолд рН-ийг урсах гелиэс 2 нэгж багаар (pH=6.8) тохируулдаг.

Уургийн дээжид ашигласан буфер нь царцмаг гельд ашигласантай адил байх ёстой.

Буфер нөөцлүүр нь 0.025М Трис, 0.192М глицинээс (pH=8.8) бүрдэнэ.

Глицин нь -1 цэнэгтэй глицинат ион болон 0 цэнэгийн тортой звиттер ионтой байдаг                                                                                     NH₃CH₂COOH=NH₂CH₂COO^–+H⁺        

Цахилгаан орон үүсэх үед хлорид, уураг, бромфенол ба глицинат анион нь бүгд анод руу шилжинэ. Гэхдээ глицинат ион хэвээр дээжийн буфер болон царцмаг гель рүү ордог ба бага рН-тай тулгарч хөдөлгөөнгүй звиттер ионы үүсэх чиглэлд тэнцвэр шилжинэ. Глицин звиттер ионы задрал дээж болон царцмаг гель рүү хөдөлж гүйдлийн урсгал бууруулах хөдөлгөөнт ионы хомсдол үүсгэдэг. Гэхдээ гүйдлийг бүх цахилгаан системээр тогтмол барих ёстой. Хүчдэлийн өсөлтөөр түрүүлэгч хлорид ион болон хоцрогч глицинат ион хоорондох талбайд гүйдэл тогтмол болно. Үр дүн нь хлорид ион ба глицинат ион хооронд тохиолдох хүчдэлийн градиент маш өндөр байршина. Энэ нөхцөлд бодит ионы хөдөлгөөнүүд глицинат<уураг<ВВ<Cl байна.

Энэ хүчтэй орчны соронзон оронд анион шинжтэй уургууд бүгд түргэн миграцилна. Царцмаг гель энэ прогрессд саад болохгүй том нүхтэй байдаг.Хэрвээ уургийн аль нь ч түрүүлэгч хлорид ионыг гүйцвэл хаа сайгүй хлорид ион байдаг ионы хомсдолгүй учраас тэдгээр нь аажим удааширдаг. Иймээс том талбайн хүч алга болно. Хлоридийн ард байсан уургийн түргэн хөдөлгөөн урд нь гарахад буурч глицинат болон  хлорид ионы хоорондын нягт дискэнд уургийн дээжийн концентраци овоорох үр дүнд дөхөж очно. Уургийн диск урсах гельтэй тулгарахад гелийн жижиг нүхээр аажим урсана. Энэ нь уургийг барьж авах жижиг глицинат ионд боломж олгоно. Царцмаг ба урсгал гель хоорондын харилцах хэсгийг дайрч глицинат ионууд 1 удаа бүтэн цэнэглэгдэж болно. Тэгээд удалгүй ион дутагдалд орно. Ийм учраас энэ цэгээс тэнд гелиэр тогтмол хүчтэй оронтой болно. Уургийн ялгалт зона электрофорезээр үргэлжилнэ. Энэ модификацийн давуу тал нь уургийн дээж ялгагч гель рүү нарийн зона шиг ордог. Үр дүнд уургийн тууз илүү нягт болж ялгалт ихэснэ.

SDS акриламид гель электрофорез

Молекулууд хоорондоо электрофорезын үед нөгөөгөөсөө салдаггүй, ковалент биш, нягт  холбоотой. Иймд уургийн холимгийг салгахад анион шинжтэй угаалгын нунтаг sodium dodecyl sulfate (SDS) ашигладаг байна. (SDS) нь уургийн гидрофоб хэсэгтэй холбогддог ба тэдгээрийн ихэнхийг дэд нэгжүүдэд салгадаг. 1.4 грам SDS 1 грам уурагтай холбогддог. SDS холбоо нь денатурацид ороод санаандгүй мушгирсан полипептидэд сөрөг цэнэг үүсгэдэг. Энэ цэнэг нь SDS үгүй үед хэвийн байдаг ямарч цэнэгийг нуудаг.

Хэрвээ уургийн дэд нэгжүүд дисульфидийн холбоогоор хоорондоо холбогдвол энэ холбоо нь SDS ба B-mercaptoethanol ба бууруулах биетийг байхад бэлтгэл дулаанаар электрофорезоос өмнө тасарна.

2 хэмжээст гель электрофорез

Энэ хүчтэй техник нь капилляр хоолойд 1 мм диаметртэй гельд ижил цэнэгийн төвлөрөл рүү уургийн холимгийг оруулна. Ижил цэнэгийн төвлөрөл нь рН градиент үүсгэхийн тулд өмнө нь гелиэр электрофорезлэгдсэн амфолитуудыг  дээж рүү хийж тусад нь электрофорезтой төстэй замаар салгадаг. Уураг хоолойгоор доош хөдлөхдөө тогтмол өсөх орчны рН-тай тулгардаг. Уураг нь давж гарсан рН шатлалдаа таарах ижил цахилгаан цэнэгт цэгт хүрдэг. Энэ рН-д уургийн торны цэнэг 0 болох ба иймд цахилгаан оронд хөдөлгөөн зогсоно.

Ижил цэнэгт төвлөрлийн төгсгөлд гель капилляр хоолойгоос гарч хавтгай гелийн оройд байрлана. Энэ дээж одоо SDS акриламид гель электрофорез руу шилжинэ. Эндээс уургийн ижил цэнэгт цэг ба молекул масс нь 2 хэмжээст электрофорезийн хувьд уургийн жигд тархалтаас хамаарахгүй юм.

Градиент гель электрофорез

Ижил цэнэгийн төвлөрөл: Энэ техник нь бас электрофокусинг гэж нэрлэгддэг бөгөөд зона электрофорезээс илүү хөдөлгөөнт холбоонд суурилдаг. Пептид амин хүчил гэх мэт амфотер бодисууд нь цахилгаан орны дагуу рН ба хүчдэлийн градиент үүсгэнэ. Анодын муж катодоос бага рН-тай ба рН-ийн градиент электрод хооронд тогтвортой байдаг. Иймд амфотер бодисууд нарийн тогтвортой туузанд төвлөрдөг. Амфолит зөөгч нь голдуу синтетик, алифатик, полиамино, поликарбоксил хүчил байдаг ба өргөн рН тууз (3-10) эсвэл өөр нарийн тууз (4-5) бүхий холимогт солилцооны чадвартай. Баганын анодын төгсгөл хүчлийн уусмал (фосфорын хүчил) агуулсан нөөцлүүртэй холбогддог ба катодын төгсгөл нь шүлтийн уусмал (NaOH) агуулсан нөөцлүүрт холбогддог. 2 нөөцлүүрийн цорго нээхэд 2 уусмал хүчиллэг анодоос шүлтлэг катод хооронд рН градиент үүсгэх багана руу нэвчинэ. Цоргуудыг хааж гүйдэл гүйлгэхэд амфолит зөөгчийн тусламжтай тэдгээр нь торын цэнэггүй рН мужид хүрэх хүртлээ шилжинэ. Энэ дээж нь цорго нээснээр баганын дээд төгсгөлд орох боломжтой болдог ба цэнэгт дээжийн бүрэлдэхүүн хоолойд цэнэггүй байх рН муж хүртлээ шилжинэ. Полиакриламид агуулж байгаа босоо багана ялгалтанд шаардагдах хугацааг бууруулах амфолит зөөгчийг шингээнэ.

Изотахофорез:

Энэ техник нь хөдөлгөөнт холбоот электрофорезын 1 хэлбэр юм. Изотахофорезын доорх зарчим нь царцмаг гелийн системд SDS полиакриламид электрофорезд хэрэглэдэг. Грекээр энэ нь ижил (Iso) хурдтай (tacho) хөдөлгөөн (phrosis) гэсэн утгатай. Ямарч цэнэглэгдсэн бодисыг изотахофорезоор ялгаж болно. Анионы холимгийг салгахад түрүүлэгч анион дээжийн ионоос өндөр хурдтай сонгогдсон байна. Хоцрогч ион глутамин дээжийн ионоос бага хурдтай сонгогдсон байна. Бүх анионууд 1 ерөнхий катион той байна. Гүйдэл урсгахад түрүүлэгч ион тохирох электрод руу чиглэн хөдлөх болно. Дээжийн ионууд хөдөлгөөнийхөө дарааллаар дараалж хоцрогч ион дээжийн ионы араас дагах болно.

Капилляр электрофорез: Метаболит, эм, амин хүчил, нуклейн хүчил, карбогидрат, пептид ба уураг зэрэг биологийн сонирхолтой молекулуудыг ялгахдаа тэдгээрийн ионы шинж болон хэмжээнд суурилсан өргөн хэрэглэгддэг электрофорезийн 1 төрөл юм. Уураг, пептидийн капилляр ялгалт нь цэнэгийн харьцаанд суурилдаг.