EcoRI рестрикцийн энзимээр ДНХ таслах протокол

endonuclease2

Онолын хэсэг

pET-28a-c(+) вектор нь N-терминал His-Tag (тромбин) Т7-Tag бүтэцтэй атлаа дээр нь нэмэлт С-терминал His-Tag дараалалтай байдаг юм.

Т7 РНХ полимеразагаар транскрипцид орсон кодлогч хэсгийн клонинг/экспрессийн хэсгийг харуулсан диаграмм дээр бид ажилласан болно. Бид cloned insert-ийг хэрчиж авахын тулд GAATTC дарааллыг таньж тасалдаг EcoRI-г сонгон авсан.

Хэрэглэгдэх урвалж, багаж

10х буффер

Плазмид

EcoRI (10µг/мл)

Нэрмэл ус

1,5 мл tube

Усан ванн

Электрофорезийн аппарат

UV-транслюминатор

Ажлын явц

Бидний туршилтаар EcoRI ферментийг сонгож авсан бөгөөд

Novagen-ий pGEM Teasy-г 5µг/мл концентрацитайгаар 1 µл-г авч

EcoRI-г 10u/мл концентрацитайгаар 2 µл-г

10Х буфферийг 1,5 µл-г

Нэрсэн ус 10,5 µл-г авч ашиглана.

Дараа нь 15µл уусмалаа 37ºС-д нэг цаг инкубацлана. Гель электрофорезоор гүйлгэнэ.

Гель электрофорез

Ажлын явц

35 мл ТАЕ-д 7% байхаар бодож 0,24 г агароз MP-г нэмж уусгана.

Агарозыг уусгаж өгөхийн тулд буцалгана. Гелийг бага зэрэг хөргөөд дараа нь гель хийх савандаа цутгана. 30-40 минутын дараа гель бүрэн хатах болно.

Loading dye буюу бромфенолын будгийг гүйлгэх дээжин дээрээ нэмж өгнө. Гельнийхээ нүхэнд  будагдсан дээжээ хийж өгнө.

Бид дээжээс 9 µл-г, нэрсэн ус 5 µл, будаг 3 µл хийж нийт 17 µл уусмалыг 100 Вольтоор ойролцоогоор цаг орчим гүйлгэсэн. Маркер болгон Kilobase ladder,

λ-ВSL-г ашигласан.

Гүйдэл гүйлгэж дууссаны дараа дээжээ этидийн бромидоор 30 минут будав. 10 минут усаар угаав.

Үр дүн

cloned insert

UV-транслюминаторт гелээ харав. EcoRI-р ДНХ-г тасалсан байдал. 300-500 bp-ийн орчим тод бандууд үүссэн байгаа нь харагдаж байна. 300-400 bp-ийн орчимд cloned insert бүрэн тасарсан гэж үзэж байна.

Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s