EcoRI рестрикцийн энзимээр ДНХ таслах протокол

endonuclease2

Онолын хэсэг

pET-28a-c(+) вектор нь N-терминал His-Tag (тромбин) Т7-Tag бүтэцтэй атлаа дээр нь нэмэлт С-терминал His-Tag дараалалтай байдаг юм.

Т7 РНХ полимеразагаар транскрипцид орсон кодлогч хэсгийн клонинг/экспрессийн хэсгийг харуулсан диаграмм дээр бид ажилласан болно. Бид cloned insert-ийг хэрчиж авахын тулд GAATTC дарааллыг таньж тасалдаг EcoRI-г сонгон авсан.

Хэрэглэгдэх урвалж, багаж

10х буффер

Плазмид

EcoRI (10µг/мл)

Нэрмэл ус

1,5 мл tube

Усан ванн

Электрофорезийн аппарат

UV-транслюминатор

Ажлын явц

Бидний туршилтаар EcoRI ферментийг сонгож авсан бөгөөд

Novagen-ий pGEM Teasy-г 5µг/мл концентрацитайгаар 1 µл-г авч

EcoRI-г 10u/мл концентрацитайгаар 2 µл-г

10Х буфферийг 1,5 µл-г

Нэрсэн ус 10,5 µл-г авч ашиглана.

Дараа нь 15µл уусмалаа 37ºС-д нэг цаг инкубацлана. Гель электрофорезоор гүйлгэнэ.

Гель электрофорез

Ажлын явц

35 мл ТАЕ-д 7% байхаар бодож 0,24 г агароз MP-г нэмж уусгана.

Агарозыг уусгаж өгөхийн тулд буцалгана. Гелийг бага зэрэг хөргөөд дараа нь гель хийх савандаа цутгана. 30-40 минутын дараа гель бүрэн хатах болно.

Loading dye буюу бромфенолын будгийг гүйлгэх дээжин дээрээ нэмж өгнө. Гельнийхээ нүхэнд  будагдсан дээжээ хийж өгнө.

Бид дээжээс 9 µл-г, нэрсэн ус 5 µл, будаг 3 µл хийж нийт 17 µл уусмалыг 100 Вольтоор ойролцоогоор цаг орчим гүйлгэсэн. Маркер болгон Kilobase ladder,

λ-ВSL-г ашигласан.

Гүйдэл гүйлгэж дууссаны дараа дээжээ этидийн бромидоор 30 минут будав. 10 минут усаар угаав.

Үр дүн

cloned insert

UV-транслюминаторт гелээ харав. EcoRI-р ДНХ-г тасалсан байдал. 300-500 bp-ийн орчим тод бандууд үүссэн байгаа нь харагдаж байна. 300-400 bp-ийн орчимд cloned insert бүрэн тасарсан гэж үзэж байна.

Advertisements

One thought on “EcoRI рестрикцийн энзимээр ДНХ таслах протокол

Хариу Үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

Та WordPress.com гэсэн бүртгэлээрээ сэтгэгдэл бичиж байна. Гарах /  Өөрчлөх )

Google+ photo

Та Google+ гэсэн бүртгэлээрээ сэтгэгдэл бичиж байна. Гарах /  Өөрчлөх )

Twitter picture

Та Twitter гэсэн бүртгэлээрээ сэтгэгдэл бичиж байна. Гарах /  Өөрчлөх )

Facebook photo

Та Facebook гэсэн бүртгэлээрээ сэтгэгдэл бичиж байна. Гарах /  Өөрчлөх )

w

Connecting to %s