Гидроксилапатит хроматограф

1. Ерөнхий хэлэлцүүлэг

А. Гипроксилапатит баганыг бэлдэх

Баганыг гипроксилапатитаар багцалсны дараа буферийг фосфатын буферийн дор хаяж нэг баганатай тэнцвэржүүлэх хэрэгтэй. Тэнцвэржүүлэлтэд хэрэглэгдэх фосфатын концентрациас гидроксилапатитийн холбогдох шинж чанар нь хамааралгүй байдаг. Сонирхсон уургийн холбогдох болон хандлах нөхцөлүүд бүрдсэний дараа ариутгагч болон натрихлор, фосфат агуулсан буферээр баганыг угааж тэнцвэржүүлнэ.

Б. Ялгаатай холбогдолт ба хандлалт

Уургууд гипроксилапатиттай хоёр замаар харилцан үйлчлэлцдэг. Уургийн хасах цэнэгт хэсгүүд нь гидроксилапатитийн гадаргын Ca2+  ионтой харилцанүйлчлэлцдэг бол уургийн + цэнэгт хэсгүүд нь фосфатын групптэй харилцан үйлчлэлцдэг. Гидроксилапатитийн хроматограф нь анион солилцооны тэжээлийн орчны шинж чанартай төстэй. Хүчиллэг болон саармаг уургуудийн хувьд фосфат нь үндсэн хандлагч болж өгдөг. Фосфат нь EDTA болон цитратийн адил гидроксилапатитаас Ca2+ ионыг зайлуулж баганыг уусгадаггүй.

Жич: Митохондрийн хувьд нийт уургийн 50% нь 50мМ фосфаттай гидроксилапатитийн хандлагчид холбогддог. Митохондрийн үлдэгдэл уургийн 10-20% нь 300-350мМ фосфататд хандлагддаг. Өндөр ионы хүч нь хүчиллэг болон саармаг уургийг хандлахад хангалттай байдаггүй тул фосфатын концентрацийг давсны концентраци ихсэх үед бууруулдаг.  Ионы хүчийг ихэсгэх нь гидроксилапатитийн гадаргын фосфаттай үйлчлэлцэх уургийн харилцан үйлчлэлд нөлөөдөг. Энэ харилцан үйлчлэлд уургийн суурилаг бүлгүүд оролцдог тул суурилаг уургууд нь илүү хандлагддаг.

Жишээ: 110мМ натрихлор ба 85мМ фосфатыг агуулсан буферийг ашиглан гидроксилапатитийн баганад ионы хүчийг (250мМ натрихлор) ихэсгэсэн тохиолдолд  цитохром С хандлагдаж комплекс III холбоотойгоор үлддэг.

 2. Мембраны уургуудийн цэвэршүүлэлтийн эхний алхмууд

a)    10 мМ эзэлхүүнтэй фосфатад, рН 7.0 үед гидроксилапатитыг суспензлэнэ.

b)    Эхний баганыг 10мМ-ын натрифосфат, рН 7, 100-200мМ натрихлор, 0.1-0.5% тритон Х-100-аар тэнцвэржүүлнэ. Нэмэлт багануудыг илүү их фосфат (50, 100, 150 мМ) агуулсан буферээр тэнцвэржүүлнэ.

c)    Эхний баганад 10мМ фосфаттай хамт уургийн дээжийг оруулж өгнө. Баганыг  0.5%-ийн тритон х-100 нэмсэн урьдынхтай адил давсны концентрацитай буферээр угаана.

d)    Гидроксилапатитад сонирхсон уураг холбогдохгүй байвал энэ нь давуу тал болж болох юм. Учир нь ихэнхи бохирдуулагч уургууд нь фосфатын концентрацитай үед гидроксилапатитад хуримтлагддаг.

e)    Уураг хэрэв холбогдвол 50,100,150 мМ натрийн фосфат агуулсан дээжүүдийг нэмэлт багануудад хэрэглэнэ. Урьд өмнөх фосфатийн концентрацийг агуулсан атлаа 0.5%-ийг нэмсэн буферээр угаана.

Жич: Буфер дэх ариутгагчийн концентраци нь 0.5 нь байх ёстой. Учир нь бага концентраци нь 0.05% тритон х-100 уургийн агрегациас сэргийлэх үүргээ алддаг. Энэ тохиолдолд бохирдуулагч уургууд нь тохиромжит фосфатын концентрацид үр дүнтэйгээр зайлуулагддаггүй. Өндөр фосфатын концентрацид уургууд нь холбогдсон липидийн хамт хандлагддаг бөгөөд энзимийн идэвхи мөн хадгалагдана. Фосфатын градиентийг хэрэглэхэд дээд липиджсэн делипидацид орсон уургууд үүсдэг тул тэднийг олж тогтооход хэцүү байдаг. Делипидацид ордоггүй уургуудийн хувьд шатлан фосфатын хэрэглэдэг хандлалтын арга нь градиент хэрэглэснээс илүү үр дүнтэй байдаг.

f)     Цэвэршүүлэлтийн үед сонирхсон уургаас бусад бохирдуулагч уургуудийг холбогдохоос сэргийлэх фосфатын концентрацийг сонгох хэрэгтэй. Энэ баганаар дээж гүйлгэх нь тогворжуулагч ханасан ариутгагч мицеллүүдийн хамт явагдах угаалтын эхний алхам болдог. Гидроксилапатитад холбогддоггүй  бохирдуулагч уургуудийн %-иас хамаараад баганад хэрэглэх уургийн хэмжээг  ихэсгэж болно.

g)    Дараагийн угаах шатанд урьв өмнөхтэй адил давсны концентрацитай үед ариутгагчийг угаагч буфер дээр нэмж өгнө. Хэрэв энэ угаалтын шатанд сонирхсон уураг денатурацид орвол Batch процедури руу шилждэг.

h)   Хандлах буферийн ариутгагчийн концентраци нь ямар нэг муу нөлөө үзүүлдэггүй. Учир нь уургаас салсан липидүүд уурагтай хамт хандлагддаг.

3. Хроматограф Batch-ын эсрэг

Олон мембраны уургуудийн бүтцийн нийлмэл байдал ба каталитик идэвхийн липидээс хамаарсан хамаарлаас болоод онцгой мембраны уургийн салгалтын аргыг хэрэглэх болдог. Ариутгагчаар өөрчлөгддөг уургууд баганад холбогдсон тохиолдолд Batch процедури нь хоёр шалтгааны улмаас илүү үр дүнтэй болдог. Нэгдүгээрт: Batch-ийн үйлчлэлд хроматографаас илүү хурдан байдаг. Хоёрдугаарт: Угаагч буферт ариутгагч байх нь Batch процедури дахь ариутгагч фосфолипидийн харьцааг өөрчилдөг. Гэхдээ энэ өөрчлөлт нь угаалтын шат болгонд нэг удаа явагддаг тул хангалттай хэмжээний липид уурагт холбоотойгоор үлддэг.


Advertisements

One thought on “Гидроксилапатит хроматограф

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s