Саузерн болон Вестерн блоттинг

Саузерн блоттингийн шат дараалал

  1. Өндөр молекулт ДНХ-г рестрикцийн эндонуклеазагаар тасалж жижиг хэсгүүд болгоно.
  2. ДНХ-ийн фрагментүүдийг агарозын гель дээр гүйлгэнэ.
  3. Хэрэв ДНХ-ийн зарим нь 15 kb-с их байвал блоттинг хийхээс өмнө гелийг хүчлээр үйлчлүүлэх нь бий. Жишээлбэл, HCl-р үйлчлүүлэхэд ДНХ-ийн фрагмент депуринжин ДНХ-ийн илүү бага молекулт хэсгүүдийг үүсгэж гелээс мембран руу шилжихэд илүү дөхөмтэй болгодог.
  4. Хэрэв шүлтийн трансферийн арга хэрэглэгдэж буй бол ДНХ-т гелийг шүлтийн (ихэвчлэн натрийн гидроксид агуулсан) уусмалд байлгаж давхар гинжит ДНХ-г денатурацид оруулдаг. Денатураци явуулахад сөрөг цэнэгт ДНХ-г эерэг цэнэгт мембранд холбогдож өгөх боломжийг дээшлүүлдэг. Шүлтээр үйлчлүүлж өгөхөд үлдэгдэл хэлбэрээр оршиж байсан РНХ-г мөн устгаж өгдөг.
  5. Нитроцеллюлоз юм уу найлон мембраныг гелийн дээр эсвэл доор байрлуулдаг (энэ нь трансферийн чиглэлээс хамаарна). Гельд даралтыг тэнцүү хуваарилсан байдаг. Өндөр усны потенциальтай бага усны потенциальтай капиллярийн трансфер явагдаж ДНХ-г гелээс мембран руу шилжүүлдэг. Ион солилцооны харилцан үйлчлэл нь ДНХ-г мембрантай холбоход мембраны нэмэх цэнэг, ДНХ-ийн хасах цэнэг дээр тулгуурлан холбодог.
  6. Мембраныг үүний дараа 60-100°С-д байлгадаг. Энэ нь ДНХ-г мембрантай ковалентийн бат бөх холбоогоор холбогдоход тусалдаг.
  7. Мембраныг дараа нь ДНХ-ийн тодорхойлох ёстой секвенсийг агуулсан ДНХ-ийн пробтой хамт гибридизацид оруулна. Проб ДНХ-г радио идэвхит байдлаар болон флуоресцент, хромогеник будгаар тэмдэглэсэн байдаг. Зарим тохиолдолд проб нь РНХ ч байж болдог. Ихэнх тохиолдолд гибридизацид яргай загасны спермийн ДНХ, ионгүйжүүлсэн формамид, SDS мэтийн детергентийг ашигладаг.
  8. Гибридизацийн дараа илүүдэл пробийг угааж, гибридизацийн үр дүнг тооцохдоо мембранаа рентген туяагаар үйлчлүүлэн авторадиографийг нь гаргадаг. Хэрэв хромогеник тэмдэглэлт хийсэн бол мембран дээр өнгөөр ялгарах болно.

Вестерн блоттинг

Эдийн гомогенат болон ханднаас тодорхой уургийг таних арга юм. Энэ нь эхлээд гель электрофорезоор натив болон денатурацид орсон уургуудийг полипептидийн уртаар нь салгадаг. Уургуудийг дараа нь нитроцеллюлоз болон PVDF мембран руу трансфер хийж дараа нь пробоор (антибоди) үйлчлүүлнэ. Одоогоор олон мянган уургуудад зориулсан антибоди (моноклонал болон поликлонал) хийдэг компаниуд бий болжээ. Худалдааны антибоди нь үнэтэй байдаг ч уурагтай холбогдоогүй антибодийг дахин хэрэглэж болдог байна.

Эдийн бэлдмэл хийх

Дээжийг бүхэл бүтэн эд болон эсийн өсгөврөөс авж болно. Ихэнхи тохиолдолд хатуу эдийг механик аргаар холигч, гомогенизатор, соникатор зэргийг ашиглан маш жижиг хэсгүүд болгоно.

Протеаза, фосфатаза ферментүүдийн ингибиторуудыг эс өөрийн энзимээр өөрийн уургийг задлахаас сэргийлэх зорилгоор нэмж өгдөг.

Гель электрофорез

Уургийг салгахад гель электрофорезийг ашиглана. Уургийг гель электрофорезоор салгахдаа ижил цахилгаан цэнэгийн цэг (pI), молекул жин, цахилгаан цэнэгээр нь юм уу эдгээр шинж чанарын нийлүүлсэн байдлаар нь салгадаг. Салгалтын мөн чанар нь гелийн байдал, дээжийг үйлчлүүлсэн байдлаас хамаарна.

Мөн уургийг электрофорез гүйлгэн хүчдэл өгөхдөө хоёр хэмжээст гелийг ашиглаж болно. Энэ тохиолдолд нэг дээжний уураг хоёр чиглэлд гүйдэг. Үүний нэг чиглэлд нь изоэлектрик цэгийн утгаараа, нөгөө чиглэлд молекул массаараа гүйдэг.

Шилжүүлэлт

Уургуудийг антибодийн танилтад бэлэн болгохын тулд гелээс мембран руу шилжүүлэх хэрэгтэй болдог. Уургийг трансфер хийхдээ капиллярийн аргаас гадна электроблоттингийн аргыг ашигладаг. Энэ тохиолдолд цахилгаан гүйдлийг ашиглан PVDF болон нитроцеллюлозын мембран руу шилжүүлдэг. Уураг нь мембрантай гидрофоб болон цэнэгт харилцан үйлчлэлээр холбогддог.

Нитроцеллюлозын мембран нь PVDF-ээс хямд байдаг ч илүү амархан хугарамхай байдаг. Мембраныг Coomassie болон Ponceau S гэсэн будгаар будаж нэвчилт явагдаж байгаа эсэхийг шалгадаг.

Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s