Ковалентийн болон Гидрофоб хроматограф, гель фильтраци

Хатуу тулгуурт уургийг ковалент холбоогоор холбох хэд хэдэн функциональ группийг энэ аргад ашигладаг. Ковалент холбоонд хэрэглэгддэг уургийн цор ганц функциональ групп бол цистейний сульфгидрил групп юм. Энэ нь дисульфидийн групптэй харилцан үйлчлэлцдэг. Уураг түлгуур хоёрын хооронд үүссэн дисульфидын холбоо ангижруулагч агентуудын нөлөөгөөр амархан тасардаг.

1. Тиолийн гельт тэжээлийн орчин

Хэд хэдэн компаниуд тиолийн гельт тэжээлийн орчинг дисульфид хэлбэр юмуу эсвэл тиолийн хэлбэрээр нь үйлдвэрлэдэг. Эдгээрийг хэрэглэсний дараа тулгуурыг дисульфидээр дахин идэвхижүүлдэг.

2. Хроматографийн үе шатын тодорхойлолт

a)    Эхлэлийн буфер дэх гелийг детергентгүйгээр тэнцвэржүүлнэ. Тиолийн группийг агуулсан группууд нь рН 8 үед холбогддог.

b)    Детергент агуулсан эхлэлийн буферээр баганыг угаана.

c)    Гомогенжин ууссан мембраны уургуудыг бэлдэнэ. Энэ нь ихэвчлэн ультрацентрифугийн дараа үүссэн гадаргуугийн бодисуудыг оролцуулдаг.

d)    0.05-0.5%-ийн детергенттэй эхлэлийн буферээр угаана. Хэрэв баганад сонирхсон уураг үлдэх юм бол хандлах буферуудын нэгээр угаана. Зарим тохиолдолд Batch-ийн үе шатыг ашиглах нь илүү тохиромжтой байдаг.

Гидрофоб харилцан үйлчлэлтэй хроматограф

Гидрофоб харилцан үйлчлэлтэй хроматограф (HIC) ба сөрөг фазын хроматограф (RPC) хоёрын хоорондын ялгаа нь адсорбентийн гадаргын гидрофоб лигандуудын нягтаас хамаардаг. Уургуудын гидрофоб домайнууд адсорбентуудтай харилцан үйлчлэлцэх нь RPC-д илүү өндөр байж уургийн хандлалтын хүчтэй нөхцөл шаарддаг. Энэ нь ихэвчлэн уургийн денатурацийг үүсгэдэг. RPC нь мембраны уургийн фрагментүүдийг  салгахад  маш их үүрэгтэй. HIC-д ашиглагддаг олон төрлийн тэжээлийн орчнууд нь лигандийн төрлөөрөө ялгагддаг.

Өндөр давсны концентрацитай гидрофоб матрицад уургууд адсорбцлогддог. Давсны концентрацийг бууруулах замаар десорпци явуулдаг. Гидрофоб харилцан үйлчлэлийн хүч нь температур буурж, рН өсөхөд буурдаг. HIC-г мембраны уурагт ашигласан тохиолдол маш ховор. Учир нь детергентүүд матрицад маш хүчтэй холбогддог байна.

Гель фильтраци

Гель фильтраци нь  бага хэмжээний бохирдуулагч уургууд болон илүүдэл детергентүүдийг зайлуулах хамгийн сүүлчийн цэвэршүүлэх алхам болж хэрэглэгддэг.

Жич: Гель фильтраци нь 40С-д дор хаяж 1м-ийн урттай багана дээр хэрэглэгддэг. Буферийн нэг баганын эзэлхүүн нь тэнцвэржүүлэлт явуулахад бүрэн хангалттай. Мембраны олигомержүүлэлтээс сэргийлэхийн тулд буфер детергентийн концентраци нь мицеллийн концентрациас их байх ёстой. Буферийн ионы хүч нь сонирхсон уургийн уусах чадварын лимитээс өндөр байх хэрэгтэй. Дээжийн эзэлхүүн нь баганын эзэлхүүний 1-3%-иас их байж болохгүй. Дээжийн детергентийн концентраци нь 5%-иас, уургийн концентраци нь 10мг/мл-ээс тус тус их байж болохгүй. Жижиг мембраны уургууд нь тритомицеллийн оролцоотойгоор хандлагддаг. Жишээ болгож тритомицеллийн молекул масс 90кДа гэж үзэхэд  40кДа уурагтай холбогдвол 130кДа болно. 90кДа мицеллийг 130кДа уураг детергентийн комплексоос салгахад хамгийн тохиромжтой гельфильтрацийн орчин бол онолын хувьд Sephadex G-200 юм. Резолюцийн бага зэргийн алдагдалтайгаар бусад гельфильтрацийн баганыг хэрэглэж болно. Эдгээрт  өөр өөрийн гэсэн салгах шинж чанартай Ultrogel AcA 34, Sephadex G-150, Sephacryl S-300 зэрэг тэжээлийн орчин ордог.

Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s