Aspergillus-ийн төрлийн мөөгнүүдээс фермент ялгаж авах

Кoji хөгц мөөгнүүд нь Aspergillus –ийн хэд хэдэн зүйлийн холимог байдаг. Үүнийг зүүн азийн орнуудад олон зууны турш хэрэглэсэн билээ. Тэдгээрийг шар буурцаг, улаан буудайн холимогийг задлан шар буурцгийн сүмс гарган авахад хэрэглэдэг.

Тэдгээрийг мөн цагаан будаан дахь цардуулыг задалж саки болон бусад нэрмэл ундаа гарган авахад хэрэглэдэг. Цардуул их агуулсан будаа, төмс зэргээс архи нэрэн гаргаж авахад  Saccharomyces-ийн төрлийн мөөгнүүд цардуулыг задалж чаддаггүй тул koji хөгц мөөгнүүдийг буюу жишээ нь Aspergillus oryzae-г хэрэглэдэг.

Aspergillus niger-ээc целлюлолитик ба пектинолитик фермент ялгаж авах

Aspergillus niger нь лемоны хүчил, глюконы хүчил зэрэг олон үйлдвэрлэлийн ач холбогдолтой бодисыг ялгаруулдаг. Aspergillus niger нь дэлхийн нимбэгний хүчлийн үйлдвэрлэлийн 99%-д хэрэглэгддэг. Зөвхөн Aspergillus niger л жилд 4,5 тонн нимбэгний хүчил ялгаруулж бид түүнийг нь хүнсэндээ хэрэглэдэг юм. A. niger нь глюкоз оксидаза, лизоцим зэрэг фермент ялгаруулдаг. Энэ хөгц мөөгийг Японд олон зуун жил хатуу гадаргуу дээр өсгөвөрлөж байсан бөгөөд одоо ч Японы ихэнх хэсэгт ийнхүү өсгөвөрлөж байна.

Гэхдээ A. niger-ийг ихэвчлэн биореакторт шингэн орчинд (submerged) өсгөвөрлөдөг бөгөөд энэ тохиолдолд маш чухал параметрүүдийг нарийн зохицуулж, боломжит хамгийн дээд зэргийн бүтээмжид хүргэдэг. Энэ нь мөн тэжээлийн орчноос ялгарсан ферментийг салгаж авахад амар байдаг.

Aspergillus niger IBT-90 хэмээх хөгц мөөгний омгийн ялгаруулдаг пектинолит, целлюлотит, гемицеллюлазууд нь бөс даавууны үйлдвэрлэлд хэрэглэгддэг юм. Целлюлозын утаслагаас тогтсон нэхмэл даавуунуудыг дээрх ферментүүдийн холимог байдлаар үйлчилдэг ажээ. Тэрхүү холимогийг бэлдэхэд фермент тус бүрийг хэдий хэмжээтэй холих пропорци нь маш чухал юм.

Целлюлозын утаслагаас тогтсон нэхмэл даавуунуудад нь хөвөн, маалинга зэргээр хийсэн даавуунууд ордог. Ферментийн нийлэгжлийг явуулагч хөгц мөөгний өсгөврийн орчингийн найрлага, макро болон микро-элементүүдийн төрөл, хэмжээ зэргийг тодорхой тооцоогоор гаргаж ирдэг.

Хөвөн, маалинга зэрэг нь байгалийн гаралтай бөс даавуу гаргахад хэрэглэгддэг. Эдгээрийн найрлаганд нь целлюлозоос гадна пектин, гемицеллюлоз, лигнин, тос зэрэг ордог. Уламжлалт аргаар хөвөн, маалингыг шүлтэнд уусган гемицеллюлоз, пектиныг зайлуулдаг. Энэ аргын нэг муу тал нь маш их хэмжээний бохир хаягдал ус гардагт байдаг.

Дөрвөн A. niger-ийн омгийн 10 спорын 100 μl суспенз Петрийн аяган дээр ургуулж будсан байдал.

Aspergillus niger-ээс гадна Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Myrothecium, Chaetomi­um зэрэг нь целлюлолитик ферментүүд ялгаруулдаг билээ. Дээр дурдсан төрлүүдээс ялгаатай нь Aspergillus niger-ийн метаболитууд нь хүнд ямар нэг хор учруулахгүй тул ерөнхийдөө аюулгүй (GRAS) гэж тооцогдсон байна. Тиймээс үүнийг хүнсний үйлдвэрт ч хэрэглэж болно. Фермент ялгаруулах үйлдвэрлэлийн процесс дахь хамгийн чухал зохицуулалтыг индукц, катаболик репрессээр гүйцэтгэдэг. Өөрөөр хэлбэл эцсийн бүтээгдэхүүнээр ингибиц буюу хязгаарлалт хийдэг гэсэн үг юм.

Целлюлоз, целлобиоз, лактоз, софороз, тиоцеллобиоз, карбоксиметилцеллюлоз нь целлюлолитик ферментийн нийлэгжлийг өдөөгч болж өгдөг. харин пектинолитик ферментийн нийлэгжлийг өдөөгч олон төрлийн бодис байдаг. Пектин болон пектиний хүчлийг ихэвчлэн индуктор болгон ашиглана. Пектинолитик ферментийн нийлэгжлийг өдөөх зорилгоор фруктоз, манноз, сахароз, целлобиозыг бас ашиглаж болдог.

Целлюлоз, пектин, гемицеллюлоз нь маш нарийн бүтэцтэй тул ферментүүдийг маш нарийн харьцаатайгаар хольсон холимогоор үйлчлэх ёстой. Целлюлолитик ферментүүдэд нь 4 төрлийн гликозид гидролаза ордог. Гемицеллюлозын гидролиз нь гидролаза, естеразын давхар үйлчлэлийг шаарддаг. Харин пектины гидролиз нь гликозид гидролаза, эфир гидролаза, лиаза шаарддаг.

Aspergillus niger IBT-90 нь пектинолитик болон целлюлолитик ферментүүд, гемицеллюлазаг нийлэгжүүлдэг. Aspergillus niger IBT-90-ийн ферментийн биосинтезийг явуулахад математик оптимизаци хэрэглэсэн. Өсгөвөр олон төрлийн эрдэс давс агуулна: KH2PO­4, CO(NH2)2, CaCl2·6H2O, MgSO4·7H2O, FeSO4, CoSO4, MnSO4, ZnSO4 ·7H2O, CuSO4·5H2O. Өсгөврийн орчинд нүүрстөрөгчийн эх үүсвэр нь алимны пектин, AVICEL микрокристал целлюлоз болон овъёос, амуу тариа, хөвөнгийн тоос зэрэг целлюлозит материал болдог. Өсгөврийн орчинг 20 минут 120°C-т ариутгана.

Хөгц мөөгний омгоо 300 мл-ийн конусан шилэн саванд 50 мл өсгөврийн шингэнтэй цуг хийж 30°C-т 200 эрг/мин давтамжтай сэгсрэгч дээр байрлуулна. Целлюлотик ферментүүд болох эндо-1,4-β-глюканаза, β-глюкозидаза, экзо-целлобиогидролаза, FPA ба эндо-1.4-β-ксиланаза зэргийн идэвхийг Сомогый-Нельсоны аргаар эдгээр ферментүүд карбоксиметилцеллюлоз, салицин,  AVICEL-микрокристал целлюлоз, Ватман №1 хроматографийн цаас, хус модны ксилан зэрэгт үйлчлэн ангижруулан гаргасан сахарын хэмжээгээр (μМ/мин = J) нь тодорхойлдог.

Нийт пектинолитик ферментийн идэвхийг (°PM) тодорхойлохдоо пектинолитик ферментүүдийн нөлөөллөөс үүдэж өөрчлөгдсөн алимны пектины наалдамхай байдлыг хэмжиж тогтоодог.

Доорх хүснэгтэд математик оптимизацид оруулсан параметрүүдийн 4 төрлийн өсгөвөрлөлтийн үе дэх утгуудын өөрчлөлтийг харуулсан болно. Параметрүүдийг тэмдэглэсэн байдлыг, хэмжих нэгжийн байдалтай хамт мөн харуулсан байна.

Тэмдэг Оптимизацид оруулсан параметрүүд нэгж xo Δx xg xd
x1 Кристал целлюлоз % 1.00 0.50 1.50 0.50
x2 Пектин % 3.00 2.00 5.00 1.00
x3 Амууны соёолж % 4.00 2.00 6.00 2.00
x4 Тэжээлийн орчны анхны рН рН утга 4.5 1.0 5.5 3.5
x5 Өсгөврийн хугацаа Өдөр 7 3 10 4
x6 KH2PO­4 g/l 6.44 3.20 9.64 3.24
x7 CO(NH2)2 g/l 2.86 1.40 4.26 1.46
x8 CaCl2·6H2O g/l 0.60 0.30 0.90 0.30
x9 MgSO4·7H2O g/l 0.36 0.20 0.56 0.16
x10 FeSO4 mg/l 6.57 3.20 9.77 3.37
x11 CoSO4 mg/l 1.03 0.50 1.53 0.53
x12 MnSO4 mg/l 1.02 0.50 1.52 0.52
x13 ZnSO4 ·7H2O mg/l 0.28 0.10 0.38 0.18
x14 CuSO4·5H2O mg/l 1.65 0.80 2.15 0.85

Оптимизацид хэрэглэгдсэн олон талыг хамарсан математик аргачлалууд нь оптимум нөхцөл, үнэлэмжийг тогтоох үйл явцыг түргэн, үр дүнтэй болгож өгч байгаа юм­.

Биофильм дээрх Aspergillus niger-ээс лигноцеллюлолитик фермент ялгах

Өмнөх Aspergillus niger-ээс фермент ялгаруулан түүнийг нь салгаж авах процесс submerged буюу шингэн орчинд ферментацийг явуулсан бол энэ удаад биофилльм дээр бэхжүүлсэн Aspergillus niger ATCC 10864 омгийн фермент ялгаруулалтын талаар товч авч үзэх болно. Биомассын эцсийн бүтээгдэхүүнийхээ хувьд биофильм нь шингэн орчингоосоо илүү бага байдаг ч 20% этилен гликолоор үйлчлүүлэхэд ялгарсан ксиланазагийн идэвх 2 дахин ихэссэн байна.

Целлюлаза нь олон тооны үйлдвэрлэлд буюу жимс ногоо боловсруулах, хүнсний зарим үйлдвэр, бөс даавууны үйлдвэрлэлд хэрэглэгддэг. Энэхүү целлюлазаг ихэвчлэн шингэн орчинд өсгөвөрлөсөн Aspergillus-ийн төрлийн хөгц мөөгнөөс гаргаж авдаг. Харин хатуу төлвийн ферментаци зарим тохиолдолд хэрэглэгддэг. Хатуу төлвийн ферментацийн гол давуу тал нь технологийн багаж, техникийн ашиглалтын зардал бага, гэхдээ хангалттай хэмжээний бүтээгдэхүүн өгдөг явдал юм. Мөн эсийн системд усны хязгаарлалт тогтоож өгдөг тул бүтээгдэхүүний концентраци их үүсдэг буюу ялгаж авахад төвөггүй болдог юм.

Aspergillus niger-ийн биофильм дээр наалдсан байдлыг харуулсан Крио-сканнинг электрон микрограф. a, c дээр усны идэвхжил 0.976, b, d дээр усны идэвхжил 0.942, 20% этилен гликолоор үйлчилсэн байдал.

Энэхүү хатуу төлвийн ферментацийн хамгийн үр дүнт хэлбэр нь биофильм болж магадгүй юм. Гэвч усны идэвхжил үүнд маш ихээр нөлөөлдөг юм. Тиймээс усны идэвхжлийг тохируулах нь нэн түрүүний асуудал болж байгаа юм. Энэ хөгц мөөгний өсөлт, метаболизмд чухал нөлөөтэй нь батлагдсан билээ. Энд бид этилен гликолыг усны идэвхжлийг дарангуйлагч болгон ашиглаж байгаа юм.

Aspergillus niger-ийн биофильм дээрх (●,●) болон чөлөөт шингэн суспенз өсгөврийн (■,■) ферментацийн хувьсагчид, цаг хугацаанаас болон 0% болон 20%-ийн этилен гликолын үйлчлэлээс хэрхэн хамаарсан хамаарлыг харуулсан графикууд.

Aspergillus niger ATCC 10864-г төмсний декстрозын ташуу царцаасан агар дээр хадгалж байсан бөгөөд 5 өдрийн өсгөврөөс спорыг 0,1% Tween 80 уусмалаас 10 мл-г авч угаан Нойбауэрын тасалгаанд тоолж 1 мл болгонд 1×106 спор байхаар тохируулан түүнийгээ нэг удаагийн тарилга хийх уусмал болгон хадгална. Энэхүү тарилга нь шингэн өсгөвөр хийхэд л зөвхөн хэрэглэгдэх юм.  Шингэн өсгөвөр, биофильм дээрх өсгөвөр хоёрт усны идэвхжил, этилен гликоль хэрхэн нөлөөлөхийг судлах энэхүү судалгааны ажлын гол зорилго юм. Гэхдээ этилен гликоль нь хоёуланд нь сөрөг нөлөө үзүүлсэн бөгөөд биофильм дээр өсгөвөрлөсөн хөгц мөөг нь энэхүү нөлөөлөлд арай бага өртсөн юм.

Aspergillus oryzae-аас трансфруктозидазаг ялгах

Трансфруктозидаза буюу нүүрсус зөөвөрлөгч ферментийг Aspergillus oryzae ялгаруулдаг. Энэ фермент нь раффиноз болон сахарозоос фруктозил бүлгийг олон тооны урвалд  косубстрат болдог фруктозил нэгдлүүд рүү зөөвөрлөдөг.

Aspergillus oryzae-с трансфруктозидазаг ялгахдаа хроматографийн болон дулаанаар идэвхгүйжүүлэх аргуудыг хэрэглэдэг. Ялгаж авсан ферментийнхээ концентратийг спиртээр тунадасжуулах замаар гаргаж авна. Концентратаас амилолитик ферментүүдийг цардуул дээр адсорбцлох замаар зайлуулна. Ийнхүү фильтрат нь трансфруктозидаза, трансглюкозидаза, мөн гидролитик ферментүүд болох инвертаза, мальтаза зэргийг агуулах болно.

Дүгнэлт

Aspergillus-аас фермент ялган бөс даавуу, жимс ногоо боловсруулах үйлдвэрт хэрэглэж эхлээд байна. Учир нь Aspergillus niger хүнсний хувьд аюулгүй бичил биетэнд тооцогддог юм. Энэхүү бие даалтад хоёр судалгааны ажлыг оруулж өгсөн билээ. Aspergillus niger-ийг бодвол Aspergillus oryzae нь илүү цөөн тооны ач холбогдолт фермент ялгаруулдаг ажээ.

Ашигласан материалууд

  1. Rita Pyć, Jadwiga Sójka-Ledakowicz, Halina Bratkowska (2003) Biosynthesis of Enzymes by Aspergillus Niger IBT-90 and an Evaluation of Their Application in Textile Technologies, FIBRES & TEXTILES in Eastern Europe October / December 2003, Vol. 11, No. 4 (43)
  2. Gretty K. Villena, Marcel Gutiérrez-Correa (2007) Production of lignocellulolytic enzymes by Aspergillus niger biofilms at variable water activities (gkvch@lamolina.edu.pe)
  3. John II. Pazur (1952) Federation Proc., 11, 267, TRANSFRUCTOSIDATION REACTIONS OF AN ENZYME OF ASPERGILLUS ORYZAE.
Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s