Монгол айрагнаас ялгаж авсан сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулсан хоёр төрлийн бактериоциныг цэвэршүүлэх ба тодорхойлох

Зорилго

Энэ судалгааны зорилго нь Монголын үндэсний ундаа болох айрганд орших сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулдаг бактериоцинуудыг ялгаж, цэвэршүүлж шинж чанарыг нь тогтоох явдал юм.

Хэрэглэсэн аргууд ба үр дүн

Enterococcus durans хэмээх бактерийг тогтоохдоо морфологи, биохимийн шинж чанар, нүүрсусны ферментаци явуулах хэлбэр зэрэг дээр нь үндэслэн API50CH хэмээх кит, 16S ДНХ-ийн анализын аргуудыг ашигласан болно.

Энэ бактерийн саармаг рН-тай тэжээлийн шингэн нь Lactobacillus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria innocua зэрэг хүнсний бүтээгдэхүүнд хортой бодис ялгаруулагч, өвчин үүсгэгч бактериудын өсөлтийг хязгаарлаж байв. Энтероцин А5-11 гэж нэрлэсэн бактерийн эсрэг агент нь дулаанд тэсвэртэй, хүчиллэг болон шүлтлэг орчинд мэдрэг биш байв. Гэвч зарим нэг протеолитик ферментийн нөлөөгөөр задарж байв. Жишээ нь, химотрипсин, протейназа К зэрэг ферментийн үйлчлэлийн дараа тухайн бактериоцины идэвхи алга болж байлаа. Гэвч трипсин, пепсин зэргийн үйлчлэлийн дараа идэвх бүрэн алдагдахгүй байв.

Гурван шаттай процедураар энтероцин А5-11А-ийн 16%, энтероцин А5-11В-ийн 64%-ийг тус тус цэврээр ялгаж авсан юм. SDS-PAGE анализаар А5-11 нь 5000 дальтон жинтэйг тогтоожээ. Хоёр бактериоцины амин хүчлийн бүрдэлийг судалж үзэхэд энэ хоёр нь лйецин, изолейцин, треонин, аланин зэргийн агууламжаараа маш их ялгаатай болох нь тогтоогдсон байна.

Дүгнэлт

Ent. durans-ийн А5-11А болон В бактериоцинууд нь бактериоцины хоёрдугаар ангид багтдаг ажээ.

Судалгааны ач холбогдол ба нөлөөлөл

Молеукл масс, амин хүчлийн бүрдэл, идэвхийн спектр зэргээс дүгнэн үзэхэд А5-11А болон В бактериоцинууд нь Enterococcus faecium-ийн ялгаруулдаг энтероцин L50A, L50B бактериоцинуудтай олон талаараа төстэй байна.

Оршил

Бактериоцинууд гэдэг нь эсийн рибосом дээр нийлэгждэг бусад бактерийн өсөлтийг хязгаарлах зориулалттай уурагт нэгдлүүд юм. Хүчтэй бактериоцинуудыг нийлэгжүүлэгч сүүн хүчлийн бактериудыг исгэсэн болон исгээгүй олон төрлийн хүнсний бүтээгдэхүүн дотроос олж болно.

Айргийг хөхүүрт бүлэхдээ урьд өдрийн айрагний 30%-г ашигладаг байна. Айрагны үндсэн микрофлорыг бүрэн тодорхойлоогүй ч Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Enterococcus spp. Зэрэг бактерийг илрүүлсэн болно.

Энтерококкууд нь бяслагний үнэр, амт бий болоход ихээхэн үүрэгтэй билээ. Энтерококкийн эд хэдэн омог нь пробиотик шинж чанартай нь батлагджээ.

Энэ судалгааны зорилго нь айрганд орших сүүн хүчлийн бактериудыг ялгаж аваад тэдгээрийн ялгаруулдаг бактериоцинуудыг цэвэршүүлж шинж чанарыг нь тогтоох явдал юм.

Сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулдаг бактериоцинуудын хоёрдугаар ангид хамаарах хэсэг нь хүнс хадгалалтад маш их үр нөлөөтэй болохыг тэдний хүчтэй үйлчлэл, физик химийн үйлчлэлд тэсвэртэй шинж чанар нь бататгаж байгаа юм.

Сүүн хүчлийн бактери хоёроос дээш тооны бактериоцин ялгаруулах нь бий. Жишээ нь, Enterococcus spp. нь энтероцин L50A ба L50B, энтероцин 1071А ба 1071В, энтероцин А ба В-г зэрэг ялгаруулдаг.

Бактериоцины ангилал

Сүүн хүчлийн бактериудын ялгаруулдаг бактериоцинуудыг 1993 онд Клаенхаммер дөрвөн анги болгон ангилсан байна. Ийнхүү ангилахдаа үндсэндээ бүтэц дээр нь тулгуурлан ангилсан байна. Одоогийн байдлаар цэвэр байдлаар нь гаргаж авсан бактериоцинуудын ихэнх нь нэг болон хоёрдугаар ангид хамаарч байгаа юм.

Грам эерэг бактериудын ялгаруулдаг бактериоцинуудад колицин, микроцин зэрэг ордог. Анх эхлэн бактериоцинуудыг үйлчилдэг организмтай нь холбон нэрлэдэг байсан ч бактериоцины үйлчлэлийн спектр өргөн байх тохиолдол олон гардаг тул энэ нэршлийг аяндаа өөрчилж эхэлсэн юм. Ийнхүү өөрчлөхдөө тухайн бактериоциныг үүсгэж байгаа организмтай нь холбон нэрлэх болжээ.

Ангилалын аргуудад нь устгалтын хэлбэрээр нь, генетик, молеукл жин ба хими, ялгаруулалтын хэлбэрээр нь ангилах аргууд ордог.

Нэгэн төрлийн ангилах арга нь бактериоцинуудыг I, IIa/b/c, III анги болгон ангилдаг.

Нэгдүгээр ангийн бактериоцинуудыг лантибиотик гэдэг ба 5 кДа-с бага хэмжээтэй бактерийн мембранд үйлчилдэг, пост-трансляцийн модификацид орсон лантионин хэмээх амин хүчлийн үлдэгдлийг агуулсан пептидүүд байдаг бөгөөд эдгээрээс хамгийн сайн судлагдсан нь низин юм. Хоёрдугаар ангийн бактериоцинууд нь дулаанд тэсвэртэй, жижиг хэмжээтэй, лантионин агуулаагүй пептидүүд байдаг ба хоёр дэд хэсэгт хуваагддаг.

Хоёрдугаар ангийн а бүлэгт багтах нь Listeria-ийн эсрэг үйлчлэлтэй YGNGVXaa­­C гэсэн төсгөлтэй пептидүүд байдаг бөгөөд эсийн маннозын зөөвөрлөлтийг зогсоодог. Хоёрдугаар ангийн b бүлэгт багтагчид нь жижиг катионы пептидүүд байдаг. Эдгээр нь эсийн протоны градиентийг эвдэг байна.

Хоёрдугаар ангийн с бүлэг дэх бактериоцинууд нь Sec-хамааралтай бактериоцинууд байдаг байна. Эдгээр нь мембраны нэвчилтэд хүчтэй нөлөөлдөг ба эсийн хана үүсэх, феромоны үйл ажиллагааг зогсоодог. Харин гуравдугаар ангийн бактериоцинууд нь том хэмжээтэй, дулаанд тэсвэртэй, уурагт бактериоцинууд байдаг.

Материал ба арга

Бактерийн омгууд ба тэжээлийн орчнууд

Бүх сүүн хүчлийн бактерийг 37°С-д MRS тэжээлийн шөлөнд өсгөвөрлөнө. Listeria innocua F ба E.coli-г 37°С-д Луриа-Бертани шөлөнд, Staphylococcus aureus CIP 9973-г 37°С-д  Тархи-Зүрхний (BH) шөлөнд, Enterococcus durans-г MRS тэжээлийн шөлөнд тус тус өсгөвөрлөнө.

Омгуудыг хэрэглэхээс өмнө тохирох шөлөнд хоёр удаа шөнөжин өсгөвөрлөнө. Сүүн хүчлийн омгуудыг судлахдаа 2003 болон 2004 онд Монголын олон газраас авсан айрагны дээжүүдийг ашигласан болно. Бүх дээжүүдийг 20%-ийн глицеролтой хамт -80°С-д хадгална. Судалгаа эхлэхээс өмнө дээжүүдийг тосгүйжүүлсэн болон саармагжуулсан сүүнд хийж 37°С-д 16-18 цаг инкубацлана.

Инкубацийн дараа бактериоцин үүсгэгч омгуудыг шууд дүрэх аргаар (direct plating method) ялгаж авна. Айрагны төрөл болгоны дээжийг гомогенизацид оруулж дараалан 0.9%-ийн натри хлороор арав дахин шингэрүүлнэ. 1мл-г үлдэгдлээс аваад 0.8% MRS агарт тариад 37°С-д инкубацлана.

Дараалсан шингэрүүлэг хийгдсэн аяганууд дээр индикатор омгуудаа нэмж тариад 37°С-д дахин 24 цаг инкубацлана. Индикатор омгуудаар Listeria innocua F, E.coli HB101, Lactobacillus bulgaricus 340 зэргийг хэрэглэв. Хязгаарлалтын зон бий болсон колонуудыг санамсаргүй сонголтоор авч MRS шөлөнд тарьж 37°С-д дахин 24 цаг инкубацлана. Айрагнаас ялгаж авсан сүүн хүчлийн бактерийн цэвэр өсгөврийг хөлдүү байдлаар 20%-ийн глицеролтой хамт -80°С-д хадгална.

Бактерийн эсрэг идэвхт байдлын шинжилгээ

Тэжээлийн шингэн болон хагасц цэвэршүүлсэн бактериоцины бактерийн эсрэг идэвхийг тодорхойлохдоо нүхээр диффузлэх аргад бараг өөрчлөлт оруулалгүйгээр ашигласан  болно. Тэжээлийн шингэнийг 15 минутын турш 4°С-д 10000 эргэлттэйгээр центрифугдэн гаргаж авна. Дараа нь 1 нормал NaOH-ийн тусламжтайгаар үүнийхээ рН-г 6.5 болгоод шүүлтүүрээр нэвчүүлнэ. Үүнд халхавч, акродиск, полиэфирийн сульфон хэрэглэгдэх ба нүхний хэмжээ 0.22 микрометр байна.

Сүүн хүчлийн бактерийн идэвхийн спектрийг тогтоохдоо тест бактеритай өсгөврөөс 100 µЛ-г 20 мЛ тэжээлт агарт орчинд ургуулж тогтвортой өсөлтийн фазад нь хүргэнэ. Петрийн аяганд дөнгөж хатсан агарт нүхнүүдийг гаргах хэрэгтэй. Энэ нүхнүүддээ шөнөжин өсгөвөрлөсөн өсгөвөртэй тэжээлийн шингэнээс 100µЛ-г хийнэ. Аягануудыг тест организм өсөх тохиромжтой нөхцөлд инкубацлахаас өмнө тасалгааны температурт, саармаг орчинд 1 цаг байлгана. Хязгаарлалтын зон дор хаяж 2 мм байх нь хангалттай.

Ферментийн нөлөөлөл, рН ба дулаанаар үйлчлэх нь

Бактериоцины идэвхид олон ферментийн үзүүлэх нөлөөг Noonpakdee (2003)-ийн аргаар тодорхойлсон болно. Шүүлтүүрээр саармагжуулсан 200 µл тэжээлийн шингэнийг 20 µЛ дараах ферментүүдтэй хамт инкубацлахдаа протейназа К, трипсин, α-химотрипсин, липаза, α-амилаза, каталаза зэргийг нийт 0.1 мг/мл  концентрацитайгаар 20 мМ/л рН 7 фосфатын буфферт хийж, пепсиныг 0.1 мг/мл концентрацитайгаар 20 мМ/л рН 2 глицин HCl-1-д хийнэ.

37°С-д 2 цаг инкубацласны дараа 100°С-д 5 мин байлгахад ферментийн идэвх алдагдана. Ферментээр үйлчлээгүй дээжийг контрол болгон ашиглана. Үлдсэн бактериоцины идэвхийг шалгахдаа Lact. bulgaricus-г индикатор организм болгон аваад тэжээлийн орчин дээрх толбоны аргаар тодорхойлно.

Идэвхт бодисын рН-ийн өөрчлөлтөд мэдрэг байдлыг шалгахдаа тэжээлийн шингэний рН-ийг NaOH, HCl-г ашиглан 2-10-ын хооронд хэлбэлзүүлдэг. 2 цаг тасалгааны температурт инкубацласны дараа рН-г эргүүлэн 6.5 болгож бактериоцины идэвхийг шалгана.

Идэвхт бодисын дулаанд тогтвортой байдлыг шалгахдаа 5 мл тэжээлийн шингэнийг буцалж буй усанд буюу 100°С-д 10, 20, 30 минут байлгана. Дараа нь автоклавт буюу 121°С-д 10, 15, 20 минут байлгана. Ийнхүү дулаанаар үйлчлүүлсэний эцэст бактериоцины идэвхийг индикатор бактери ашиглан шалгана.

Сүүн хүчлийн бактерийн омгийг таних

Бактериоцин үүсгэгч омог болох А5-11-г морфологи, биохими, генетик шинж чанараар нь таньж тодорхойлдог. Каталазын урвал, оксидазагийн тест, грамаар будагч бодисуудыг Sigma-с авсан болно. 45°С-д, рН 9.6, 4% болон 6.5%-ийн натрийн хлоридтой орчин дахь өсөлтийг шалгахдаа MRS шингэн тэжээлийн орчноо дээрх нөхцөлд инкубацлана. 3 өдрийн инкубацийн дараа 600 нм-т OD-г шалгаж өсөлт явагдсан эсэхийг шалгана.

Нүүрсусны ферментацийг APICH систем ашиглан явуулсан болно. Үр дүнг 48 цагийн инкубацийн дараа тэмдэглэж авав.

Полимераза гинжин урвалд ашигласан хромосомын ДНХ-г калийн ацетатийн аргаар бэлдсэн болно. 1 мл шөнөжин өсгөвөрлөсөн А5-11-ийн өсгөврийг центрифугээр тунадасжуулаад Т100Е буфферт (100 мМ/л Tris-HCl, pH 8, 10мМ/л EDTA) угааж, дахин суспензлэнэ.

16S рибосомын ДНХ агуулсан ДНХ-ийн фрагментүүдийг хромосомын ДНХ-с олшруулж авахдаа fD1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’), rD1 (5’-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3’) гэсэн хоёр праймер ашигласан болно. PCR явуулахдаа ДНХ-ийн thermal cycler дээр PCR tube дотор нийт 50 µл шингэн байхаас үүнд 1Х PCR буффер, 1.5 мМ/л MgCl2, 1 µг/мл ДНХ, праймер тус бүрээс 0.8 µМ/л, 0.2 мМ/л dNTP, хоёр нэгж Taq полимераза орно.

Денанатурацийг 94°С-д 1 мин, хөргөөхөд 56°С-д, өргөжилт 72°С-д 7 мин явагдана. PCR-ийн бүтээгдэхүүнийг агарозын гельд гүйлгээд этидийн бромидоор будаад хэт ягаан туяанд үр дүнгээ харна. Олшруулсан 16S рДНХ-н секвенсингийг Taq Dye-Deoxy TM Terminator cycle sequencing аргаар ABI370 автомат секвенсер ашиглан гүйцэтгэнэ.

Бактериоцины ялгаралт

А5-11-ийн шөнөжин өсгөвөрлөсөн өсгөврөөс 10 мл-г MRS-ийн 200 мл-т тарина. Үүний дараа би рН-г зохицуулаагүй нөхцөлд 20, 30, 37, 45°С-д инкубацлана. Тодорхой интервалуудад Бактерийн эсрэг идэвхийг центрифугдсэний дараа өмнө дурдсаны дагуу явуулна.

Бактериоциныг цэвэршүүлэх

37°С-д 8 цаг ургуулсан 500 мл сүүн хүчлийн бактерийн өсгөврөөс эсийг 8000 эрг/мин-р 4°С-д 20мин центрифугдэж салгана. Үүний дараа тэжээлийн шингэний рН-г 6.5 болгож тохируулна. SP-сефароз хурдан урсгалтай катион солилцогч баганад оруулж 50мМ/л фосфатын буфферээр тэнцвэржүүлнэ. Баганыг дээрх буфферээр угааж абсорцлогдсон уургийг мөн адил буффертээ 30 минутын турш давсны градиент (0-1 М/л NaCl) ашиглан хандалж авна. Урсгалын хурд 10мл/мин ба абсорбцийг 220 ба 280 нм-д тэмдэглэж авсан болно.

Катион солилцооноос гаргаж ирсэн идэвхтэй фракцийг сөрөг фазтай (RP) R1 баганад 95%-ийн уусгагч А (0.08%, v/v, TFA), 5% уусгагч В (0.08%, v/v, TFA, 80% изопропанол дахь ацетонитрил)-тэй хамт хийнэ. Хандлалтыг 20%-ийн М уусгагчийг 60% болгох градиентэд 30 минутын турш хийнэ. Урсгалын хурд нь 5 мл/мин ба абсорбцийг 220 ба 280 нм-д тэмдэглэж авсан болно. Фракцийг (5 мл) цуглуулж бактерийн эсрэг идэвхийг шалгахаас өмнө ацетонитрилийг Speed-vac concentrator-р салгаж авна. Мөн рН-г NaOH ашиглан 6.8 болгох хэрэгтэй.

Лиофилизацид оруулсан бактериоциныг сөрөг фазтай-өндөр хурдат шингэн хроматографи (RP-HPLC), Waters Alliance аппарат, Millenium програм ашиглан цэвэршүүлнэ. 100 µл бактериоциныг RP Nucleosil C18 баганад хийж 50% уусгагч С (усанд 0.11% TFA), 50% уусгагч D (80% ацетонитрил, 20% ус, 0.09% TFA) –р тэнцвэржүүлэн хийнэ. Хандлалтыг D уусгагчийг 50-100% хүргэх градиентэд 30 минутын турш гүйцэтгэнэ. Урсгалын хурд 0.8 мл/мин байна. Хандалсан уургуудийг спектрофотометрээр олж тогтоон абсорбцийг 210 болон 300 нм-т photo diode array detector (PDA 996, Waters) ашиглан цуглуулна.

Уургийн концентрацийг тодорхойлох

Уургийн концентрацийг BCA буюу бицинхонины хүчилт уургийн шинжилгээний кит ашиглан тодорхойлно.

Трицин-натри додецил сульфат-полиакриламидын гель электрофорез

Био-идэвхтэй пептидүүдийн молекул массыг хэмжихдээ трицин-натри додецил сульфат-полиакриламидын гель электрофорезийг 16.5% акриламидын гель дээр гүйцэтгэнэ. 1.06-с 26.60 килоДальтон бага молекулт уургийн маркерийг стандарт болгон ашиглана. Бактериоцины жинхэнэ массыг тогтоохын тулд трицин-натри додецил сульфат-полиакриламидын гель электрофорезийн дараа гелээ босоогоор нь зүсэн 2 хэсэгт хуваана.

Уургийн маркер агуулсан гелийн хэсгийг Coomassie R250-р будаж, нөгөө хэсгийг нь буюу зөвхөн дээж агуулж буй хэсгийг саармаг MIlliQ-р 3 цаг угаана. Хоёр дахь хэсгийг үүний дараа Lact. Bulgaricus 340-р тарьж 37°С-д шөнөжин өсгөвөрлөнө.

Амин хүчлийн анализ

Цэвэршүүлсэн уургийг Pico-Tag station-д 6 н HCl-той хамт 24 цагийн турш вакуум орчинд 110°С-д буцалгаж гидролизод оруулна. Хүчлийн гидролизийн дараа фенил изотиоцианатын (PITC) тусламжтайгаар уламжлалыг гаргана. Дараа нь Pico-Tag C18 дээр RP-HPLC-р тоо хэмжээг гаргана.

Масс спектрометр

Цэвэршүүлсэн бактериоцины электрон шүршилтийн (Electrospray) ионжуулах масс спектрометр (LC-ESI/MS) анализ нь ион баригч масс спектрометрээр хийгдэнэ. Ион баригчийг эерэг ионжуулах хэлбэрээр нь ажиллуулна. Массын өгөгдөлийг массаас цэнэг рүү шилжих (m/z) 400-2000 хүрээнд X-Calibur 1.3 гэсэн програм ашиглан олж авна.

Үр дүн

Бактериоцин үүсгэгч омгийг ялгаж авах

53 сүүн хүчлийн бактерийн омгийг айрагнаас ялгаж аван тэднийг хүнсэнд өвчин үүсгэгч бактери, хөрөнгөний мөөг зэргийн эсрэг үйлчлэлийг нь шалгасан болно. 13 ялгаж авсан омог бусад сүүн хүчлийн бактерийн эсрэг хүчтэй хязгаарлах нөлөөллийг үзүүлж байснаас гадна E. coli HB 101, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Staph. aureus ATCC 25923, L. innocua F зэргийн эсрэг үйлчлэл үзүүлж байжээ. Дараа дараагийн анализаар нэг омог болох А5-11 нь хамгийн дээд хэмжээний хязгаарлалт үзүүлдэг болохыг тогтоож цаашид нарийвчлан судлахаар болсон билээ.

А5-11 омгийг тогтоох

А5-11-ийг олж тогтоохдоо морфологи, биохими, нүүрсусны ферментацийн шинж чанарыг голчлон авч үзсэн болно. Микроскопын анализаар богино гинж үүсгэсэн коккууд байгааг харуулдаг. А5-11 нь Грам эерэг, каталаза-, оксидаза-идэвхгүй, глюкозоос хий үүсгэдэггүй, рН 9.6, 6.5%-ийн NaCl-той орчинд 10 болон 45°С-д сайн ургадаг факультатив анаэроб бактери юм. Бусад олон анализаар А5-11 нь Enterococcus durans-ийн омог болохыг хөдөлгөөнгүй баталсан билээ.

Бактерийн эсрэг идэвхийн шинжилгээ

Enterococcus durans А5-11-ийн эсгүй тэжээлийн шингэн (CFCS)-ээс ялгасан уураг нь RP хроматографиар хагас цэвэршүүлэгдсэн байх ба хэд хэдэн сүүн хүчлийн бактери, хоол хүнсэнд өвчин үүсгэгч бактериудын эсрэг идэвхийг нь шалгасан болно. Энэхүү бактериоцин нь ойр холбоотой Грам эеэрг бактериуд болох Lactobacillus, Enterococcus, Candida pseudotropicalis, Staph. aureus ATCC 25923, L. innocua F зэргийн эсрэг үйлчлэхээс гадна Грам сөрөг бактери болох E. coli HB 101-ийн эсрэг хүчтэй үйлчилж байсан юм. M17 хэмээх контрол өсгөвөр нь эдгээр бактерийн аль алины эсрэг үйлчлэл үзүүлээгүй юм.

Фермент, рН, дулааны үйлчлэлийн нөлөө

Enterococcus durans А5-11-ийн эсгүй тэжээлийн шингэн (CFCS) дээр каталазагаар үйлчлэхэд бактерийн эсрэг үйлчлэлд нөлөөлөөгүй ч устөрөгчийн хэт ислийн үйлчлэлд бактерийн эсрэг идэвх багассан байна. Гэвч протейназа К ба α-химотрипсины үйлчлэлийн дараа бактерийн эсрэг идэвх бүрэн алга болсон байна. Харин трипсин, пепсин зэргийн үйлчлэлийн дараа идэвх бүрэн алдагдахгүй байв.

Идэвхт бодис нь рН-ийг NaOH, HCl-г ашиглан 2-10-ын хооронд хэлбэлзүүлэхэд идэвхээ хадгалсаар байв. Энэ нь бусад Entorococcus-ийн омгуудын ялгаруулдаг бактериоцины рН-ийн хүрээнээс өөр байгаа юм.

Энэхүү бактериоцин нь 5 мл тэжээлийн шингэнийг буцалж буй усанд буюу 100°С-д 10, 20, 30 минут байлгахад, дараа нь автоклавт буюу 121°С-д 10, 15, 20 минут байлгахад мөн л идэвхээ хадгалж байжээ. Дулаанд тэсвэртэй шинж бол бактериоциныг хоол хүнсний хадгалалтад хэрэглэх гол шалгуур болдог юм.

А5-11 бактериоциныг ялгах ба цэвэршүүлэх

Enterococcus durans А5-11-ийг M17 болон MRS өсгөврийн шингэн дээр өсгөвөрлөдөг. 20, 30, 37°С-д инкубацласан CFCS-г шалгахад бактериоцины идэвх хэвээр байв. Хамгийн өндөр бактериоцины титрийг (1600 AU/мл) 37°С-д 6-7 цаг өсгөвөрлөсний эцэст гаргаж авдаг. Эсвэл энэ титрийг 30°С-д 9-10 цаг өсгөвөрлөж гаргаж болно. 30, 37°Ё-д CFCS дэх бактериоцины идэвх дор хаяж 16 цаг үргэлжилдэг юм.

Гурван шатат цэвэршүүлэлтийн аргыг бид хэрэглэж байна. CFCS дэх бактериоциныг рН 7 үед хурдан урсгалтай катион солилцогч SP-сефароз хроматографиар гаргаж авдаг. Ингэхдээ баганыг 50мМ/л фосфатын буфферээр тэнцвэржүүлнэ. Энэ шатанд ижил цахилгаан цэнэгийн утга нь 7-с бага байх анионик нэгдлүүд болон бодисууд хурдан урсгалтай катион солилцогч SP-сефарозын баганаар дайрч өнгөрөн бактериоцины идэвхтэй нэгдлүүд нь NaCl-ийн 0.6 ба 0.8 М/л-ийн хооронд тунадасжиж үлдэж байгаа нь энэхүү бактериоциныг өндөр катионик идэвхтэй нэгдэл болохыг илтгэж байгаа юм.

Хурдан урсгалтай катион солилцогч SP-сефароз хроматографийн дараа бактериоцины өмнөх идэвх 70%-р өссөн байна. Цэвэршүүлэлтийн дараа педиоцины бүлгийн бактериоцинуудын идэвх эрс нэмэгддэг нь цэвэршүүлэлтээс өмнө хязгаарлагч бодисууд байсныг илтгэж байгаа юм.

Хоёр дахь шатанд цуглуулсан идэвхтэй фракцуудыг RP-ийн Poros R1 хэмээх баганад хийнэ. 45%-ийн В буффертэй хамт хандлалт хийхэд хроматограм дээр бактериоцин нь хамгийн өндөр цэгийг заадаг. Энэ нь энэхүү молекулын өндөр гидрофоб чанарыг илтгэж байгаа юм. RP хроматографийн дараа тодорхой идэвх нь CFCS дэх идэвхээс 2300 дахин ихэссэн байдаг. Энэ шатанд 500 мл өсгөврөөс 1.2 г бактериоцин гаргаж авна.

Бактериоциныг RP-HPLC ашиглан цэвэршүүлэх эцсийн шатанд D буфферт 89%, 95% дээр хамгийн их ялгаралт гарсан байдаг. Энэхүү хоёр идэвхтэй дээд цэгийн бодисыг тус тусад нь ялгаж аваад дахин өмнөх хроматографид оруулж бүрэн цэвэр эсэхийг шалгадаг. Энэхүү хоёр цэг нь L. innocua F, Lact. Bulgaricus 340-ийн эсрэг үйлчлэл үзүүлдэг.

Ийнхүү энэхүү хоёр А ба В гэж нэрлэгдсэн фракцийг тус бүрийг 0.4, 0.9 грамыг ялгаж авдаг. Эдгээр тус бүрийн молекул масс нь 3.5 ба 6.5 кДа.

Масс спектрометр ба амин хүчлийн анализ

C18 дахь RP-хроматографиар цэвэршүүлсэн А ба В фракцийг урьд өмнөхтэй адил баганад тарьж масс спектрометрийн анализ хийнэ. MS/MS масс спектрометрийн анализ нь N-төгсгөлийн амин хүчил нь формил метионин болохыг харуулж байв.

Пептидүүдийг шүлтжүүлэхэд цистейн хоёр фракцийн алинд нь ч байхгүйг олж тогтоожээ. Пептидийн хагас секвенсингийн үр дүнд энэ хоёр фракц тус бүрт дор хаяж хоёр триптофанил үлдэгдэл байгааг илрүүлжээ. Амин хүчлийн анализаар хоёр фракц нь изолейцин, лизиныг ихээр агуулдаг болохыг харуулав. Энэ хоёр нь треонил, аланил, аргинил, изолейцил, лейцилийн  үлдэгдлийн тоогоороо ихээхэн ялгагдаж байв.

Хүчлийн гидролизатад мэдэгдээгүй нэгдэл огт ажиглагдаагүй байна. Хүчлээр хувирдаг триптофаны тоог энэ аргаар тогтоох боломжгүй тул спектрофотометрийн аргыг хэрэглэсэн болно.

Хэлэлцүүлэг

Хоол хүнс хадгалалтад маш их үр нөлөөтэй байж болох сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулдаг бактериоциныг ялгах, цэвэршүүлэх судалгаа нь сүүлийн үед олон эрдэмтдийн анхаарлыг татан, хөгжиж байгаа юм. Эдгээр бактериоцинууд дотроос Entreococcus-ийн омгуудын ялгаруулдаг нь ихээхэн тоотой байдаг. Entreococcus faecalis, Entreococcus faecium зэргийн ялгаруулсан бактериоциныг педиоцин-төст хоёрдугаар ангийн бактериоцинууд буюу энтероцинууд гэж нэрлэдэг.

Урьд өмнө нь хөрснөөс ялгаж авсан Entreococcus durans (L28-1)-ийн 3.4, 2.5 кДа хэмжээтэй бактериоцины идэвхтэй нэгдэл байгаа ганцхан судалгааны жишээ Entreococcus durans-ийн хувьд байгаа юм. Бидний ялгаж авсан А5-11 нь одоогоор мэдэгдэж буй бактериоцинууд дотроос хамгийн өргөн спектртэй нь юм. Мөн энэ тохиолдолд айрагнаас анх удаа бактериоцин ялгаруулдаг Entreococcus-ийн омгийг ялгаж авсан юм. Энэ нь айрагны исэлтийн процесст яг ямар нөлөөтэйг одоогоор тогтоогоогүй байгаа ч энэ омог нь өвчин үүсгэгч бактериудын өсөлтийг хязгаарласнаар хөрөнгөний мөөгийг ургах нөхцлийг бүрдүүлж өгдөг байж болох юм.

Бид Swiss-Prot, TrEMBL зэрэг автомат хайлтын системүүд ашиглан бактериоцины амин хүчлийн найрлагыг шүүлгэж үзэхэд нь А5-11А нь энтероцин L50В-тэй төстэй (6 оноо), А5-11В нь L50A-тай маш төстэй (10 оноо) байв. Бид энэ хоёр бактериоцины бүх шинж чанар дээр үндэслэн энэ хоёр нь хоёрдугаар ангийн b бүлэгт хамаарах юм гэж дүгнэв.

Энэ нь анх удаа гүүний айрагнаас ялгаж авсан бактерийн омогноос бактериоцин цэвэршүүлж авсан явдал юм. Бид энэхүү тус тусдаа хүчтэй үйлчлэл үзүүлж чаддаг хоёр бактериоциныг GRAS сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулсан бактериоцинтой адил хүнсний хадгалалтад хэрэглэхийг санал болгож байна.

Уг судалгааны эх: Purification and characterization of two bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from Mongolian airag.

by B Batdorj, M Dalgalarrondo, Y Choiset, J Pedroche, F Métro, H Prévost, J-M Chobert, T Haertlé

Advertisements

3 thoughts on “Монгол айрагнаас ялгаж авсан сүүн хүчлийн бактерийн ялгаруулсан хоёр төрлийн бактериоциныг цэвэршүүлэх ба тодорхойлох

  1. Энэ өдрийн мэнд хүргэе. Би энэ талын судалгаа хийх зорилготой байсан бөгөөд маш хэрэгтэй мэдээлэл байсанд баярлалаа. Дахин мэдээлэл илгээгээрэй.

    Like

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s