Казейн гидролизат II пептидийн функциональ шинж чанар

Оршил

Сүүлийн жилүүдэд хүнсний уургийн функциональ шинж чанарыг сайжруулах дээр ихээхэн анхаарч үзэж байгаа билээ. Хүнсний уургийн шинж чанарын функциональ тал дээр хүссэн байдалдаа хүргэх гэсэн оролдлогуудыг химийн, ферментийн, физик өөрчлөлт оруулах аргуудаар хийж байгаа болно.

Химийн аргыг ашиглах нь хүнсний аюулгүй байдалд ихээхэн анхаарах болсон хэрэглэгчдийн дургүйцлийг хүргэх болсон тул ашиглалт нь багассаар байна. Ферментийн арга нь илүү бага температур, зөөлөн нөхцөл байдалд хийгддэг тул илүү боломжтой ч протеолизын үр дүнд гарсан гашуун пептидүүд үүсэж болох ба нарийн зохицуулга бага зэрэг алдагдахад л хүссэн функциональ шинж чанараа алдах явдал их гардаг.

Ихэнх тохиолдолд цэвэр ферментүүд маш үнэтэй байдаг ба дахин хэрэглэгдэх боломжгүй байдаг. Гэвч ферментүүдийг шилний үйртэс, нунтагжуулсан яс, бүр элсэн дээр хүртэл бэхжүүлэн хэрэглэх нь ихээхэн давуу чанартай (хэд дахин хэрэглэж болно, урвалыг зохицуулахад хялбар) байдаг ч хагас задралын хугацаа нь ихэвчлэн богино байдаг юм.

Бид судалгаандаа казейныг бэхжүүлсэн трипсин, химотрипсин, розим-41 зэргийг ашиглан биореакторт гидролизод оруулсан болно. Биореактор нь 1 сарын турш тогтвортой байдлаа хадгалж чаддаг билээ.

Энэ судалгааны зорилго нь казейн дээр суурилсан бэлдмэлүүдийг гаргаж авахад зориулагдсан бэхжүүлсэн ферментэт биореакторын нөхцөлийг стандартжуулах юм.

Материал ба арга зүй

Материал

Трипсин, α-химотрипсин – Calbiochem Company

Розим-41 – Genencor, Inc.

Амино-п

ропил шил, глютаральдегид – Sigma Chemical Company

Мембран фильтер (0.45µм диаметртэй) – Millipore

Арга зүй

Казейн бэлтгэх

M.S.U-ийн цагаан идээний үйлдвэрийн тосгүйжүүлсэн шинэ сүүнээс рН 4.6 нөхцөлд коагуляци явуулан казейнийг гаргаж авсан болно.

Бэхжүүлсэн фермент бэлдэх

Ферментийг APG ширхэгүүд дээр адсорбцолж дараагаар нь глютаральдегидтэй холбоно.

Бэхжүүлсэн ферментийн идэвхийг тодорхойлохдоо 37°С-д рН8-д байх казейныг субстрат болгон авдаг.

Бэхжүүлсэн ферменттэй хамт тасралтгүй урвал явуулах нь

Казейнаас үргэлжилсэн байдлаар функциональ пептидүүдийг гаргаж авахыг өмнөх судалгааны ажилдаа дурдсан болно. 4°С-д Казейныг 0.05М Tris-HCl буфферт, рН 8.0 байх нөхцөлд авч тасралтгүйгээр урвалыг явуулдаг. Трихлорацетатын хүчлийн нөлөөгөөр хаягдал тунадасжсаны дараа Казейны модификацийг 280 нм-т хянана. Уургуудийг хэрэглэх хүртлээ хөлдөөж хадгална.

Электрофорез

Додецил сульфат натрийн полиакриламидийн гель электрофорезд (SDS-PAGE) модификацид орсон казейнаа гүйлгэж үзнэ. Гэхдээ түгээмэл SDS-PAGE-аас ялгаатай нь 7 М/дм3 мочевиныг нэмж өгдөг. Нөөц буфферт (0.192 М/дм3 глицин, 0.025 М/дм3 Tris, рН 8.3) 0.1% SDS, 0.5% Coomassie бриллиант хөх G-250 ордог.

Өндөр гүйцэтгэтгэлттэй шингэн хроматографи

Модификацид орсон казейн дээр HPLC явуулахдаа Bondaclone 10 C18, 500 Å. 250×4.6 мм баганыг ашиглана. Эсхүл Лихросфер 100 RP-8 C8 багана ашиглаж болно. Гэхдээ C8 багана ашиглаж байгаа тохиолдолд HPLC явуулахаасаа ультрафильтрацийн мембранаар шүүж зөвхөн пептидүүдийг ялгаж авах хэрэгтэй юм. 2360 Градиент Программераар, мөн даралт зохицуулагч (модель 2350), V4 абсорбци танигчтай хамт хэрэглэн модификацид орсон болоод ороогүй казейныг илрүүлж, ялгадаг. 220 нм-ийн уртад 0.1 мэдрэмжтэй мониторингийн абсорбциор илрүүлдэг.

Уусах чанар

Модификацид орсон казейны дээжийг 30 минут, рН 7.0, 25°С-д 10 мМ имидазолт буффер гидратжуулна. Үлдэгдлийг зайлуулаад уургийг тодорхойлохын тулд 1 Н NaOH-т уусгана. Үлдсэн дээжийг 2000 эрг/мин-р 10 минут центрифугдэнэ. Дараа нь супернатант дахь уургийн концентрацийг тодорхойлохдоо 1 Н NaOH-т (рН ~10.5) уусгана. Уургийн концентрацийг тооцолон гаргахдаа 280 нм ба 260 нм дэх абсорбцийг хэмжинэ.

Уургийн концентрацийг бага зэрэг өөрчлөлт оруулсан Лаурийн аргаар SDS-тэй хамт тогтооно.

Уусах чанар = шингэний уургийн агууламж/центрифугдээгүй дээж дэх уургийн агууламж ×100

Эмульсийн идэвхжлийн индекс ба тогтвортой байдал

Лиофилизаци болон модификацид орсон казейны уургийн эмульсийн идэвхжлийн индекс (EAI) болон эмульсийн тогтвортой байдал (ES) хоёрыг тогтоохдоо 0.8 мл уургийг 10 мМ/дм3, рН 7 имидазол буфферт, 0.2 мл самрын тосонд хольж соникацид оруулсны дараа тогтоодог.

Титан мокротип ашиглан 4°С-д соникацид оруулах замаар эмуульсийг бэлддэг. 150 Ваттын нийт цахилгаан чадлыг ихэвчлэн 20% хүртэл нь бууруулдаг. Энэ дээжний угаас 10 µл-ийг аваад 10 мл 0.1% SDS агуулсан 10 мМ/дм3 имидазол буфферт хольж 600 нм-т эмульсийн идэвхжлийн индекс (EAI)-ийг нь тодорхойлно.

Энд l нь см дэх гэрлийн тусах зам,  нь дисперсэд орсон фазын фракц юм. А нь 600 нм дахь абсорбци, С нь эмульсжуулэгч юм. Үр дүнгүүд нь гурван туршилтын дундажыг харуулж байгаа юм.

Тогтвортой химийн болон физик нөхцөл байдалд эмульсийг тогтворжуулахад нэг ижил эмульсжуулэгч дахин дахин хэрэглэх нь эмульсжуулэгчид гадаргуу дээр тархан зузаан давхарга үүсгэх явдал гаргадаг.

Эмульсийн тогтвортой байдал

30 минутын турш 200 эрг/мин-р микроцентрифугд тунадасжуулан эргүүлсний дараа эмульсийн тогтвортой байдлыг тогтоодог. Нарийн зүүт шприцэр бохир усан хэсгийг авчя хаяаад үлдсэн эмульс дээрээ тулгуурлан ES-ээ тооцдог.

Тос хадгалах чадамж

Модификацид орсон болон ороогүй казейны тос хадгалах чадамж нь доорх байдлаар тодорхойлогдоно. Модификацид орсон 50 мг казейн дээр 1 мл самрын тос нэмж 30 секунд вортекс дээр сэгсрээд, дараа нь 30 минутын центрифугдэнэ. Тубны дээд хэсэгт байх тосыг болгоомжтой авна. Тубны дээд хэсэгт гарч ирсэн болон нэмсэн тосны хоорондын харьцаанаас тос хадгалах чадамжийг тооцож олдог.

Дулаан тэсвэрлэх чадамж

Модификацид орсон казейныг 10 мМ/дм3 имидазол буфферт уусгаж буцалж буй усан ваннд 10 минут байлгаад 25°С хүртэл нь хөргөнө. 600 нм-ийн үзэгдэх гэрлийг халаасан болон халаагаагүй дээжүүдийн дундуур тусгаж үзээд өмнө нь нэрсэн усаар нэвтэрсэн гэрлийн хэмжээг 100% гэж авч үзээд харьцуулан үр дүнг гаргана. Халаасны өмнө болон халаасны дараа гэрлийн нэвтрэлт нь ойролцоо дээжүүдийг дулаанд тэсвэртэй гэж үзнэ.

Үр дүн болон хэлэлцүүлэг

Ферментийн модификацийн  олон янз байдлыг бий болгохдоо биореактор дахь барилтыг өөрчилсөн болно. Энэ нь 280 нм дэх модуляциар илэрхий болж, полиакриламидын гель (PAGE) дээр баталгаажсан юм.

Үндсэн казейны бүрдэл хэсгүүдийн будагдсан байдлаас харахад маш бага болон өөрчлөлт ороогүй байсан бол гипролизыг өндөр түвшинд хийсэн дээжүүд дээр бүдэг гидролизатын шугамнууд гарсан байна. Тиймээс ажиглагдсан модификаци нь зөөлөн ферментийн гидролизын үр дүнд бага хэмжээний пептидүүд салж явснаар тайлбарлаж болох юм.

HPLC дээр Bondaclone C 18 фазын багана дээр ихэнх тохиолдолд хандлалтын хэв маягт ямар нэг ялгаа илрээгүй байна. HPLC-д IM-трипсин хэрэглэсэн тохиолдолд модификаци хамгийн өндөр түвшинд илэрсэн билээ.

Уусах чанар

рН 7 имидазол буфферт байх модификацид орсон казейны уусах чанар нь ихээр өссөн байна. Хэт ягаан туяаны абсорбци, анализийн Лаурийн аргын үед дээрхтэй адил уусах чанарт өсөлт гарсан байна.

Эмульсийн идэвхийн индекс болон тогтвортой байдал

Модификаци EAI-г мэдэгдэхүйцээр өсгөсөн байна. ES зарим тохиолдолд бага хэмжээгээр багассан, зарим тохиолдолд хэвээр байсан билээ. EAI болон ES-ийн урвуу харьцаа бусад судалгаанууд дээр ч мөн дурдагдсан байдаг.

Бас нэгэн ажиглагдсан сонирхолтой зүйл бол уургийн концентрацийг ихэсгэхэд EAI-ийн утга буурж байсан явдал юм. Гадаргуугийн талбайн багасалт нь уургийн концентраци ихэсэхэд ажиглагдсан бас нэг тохиолдол бол Bovine Serum Albumin (BSA) хэрэглэх үед гарсан ажээ. BSA нь маш сайн эмульсжуулэгч бөгөөд гомогенизацийн өмнө болон гомогенизаци явагдаж байх үед концентрациас хамааралтай аггрегацийг үзүүлдэг юм. Эдгээр аггрегатууд нь гадаргууг бүрдүүлэх гол зүйлс болдог бөгөөд эдгээрээс эмульсийн зузаан хамаардаг.

Модификаци ихсэхэд EAI тодорхой утганд тултлаа өсдөг байна. Модификацид орсон бүх казейн дотроос T3 ба Т4-ийн хувьд хамгийн өндөр EAI ажигдлагдсан юм. Харин T-д хамгийн их пептид байсан ч бага EAI-ын утгыг үзүүлсэн юм.

HPLC-ийн үед C8 урвуу фазат багана дээр T3 ба Т4-ийн пептидийн агууламж нь таних босго болсон хэмжээнээс бага байсныг тогтоосон байна. Гадаргуугийн талбай дээрх уусмалын бүрхэлт дэх уургийн (эмульсжуулэгч) концентрациын өсгөлт нь эмульсжуулэгчийн нэгж массад нөлөөлсөн юм. Энэ бол маш чухал ажиглалт байсан билээ. Эмульсжуулэгчийн концентраци ихсэхэд нэгж масс дахь гадаргуугийн талбай багасаж улмаар эмульсийн зузаанд нөлөөлдөг байна.

Розим-41 хэмээх бяслагны үйлдвэрлэлд бяслагийг болох явдлыг түргэсгэхэд хэрэглэгддэг энэхүү ферментийн холимог нь бидэнд хамгийн сайн үр дүнг өгсөн юм. EAI-ийн хамгийн өндөр утга, уургийн гарц гарсан юм. Хамгийн бага модификацийн үед л уургийн гарц хоёр дахин өссөн билээ. Харин ESAVE-ийн хувьд ямар ч ихсэлт ажиглагдаагүй юм. Энэ нь бүх төрлийн модификацийн үед нэг хэвэндээ байсан юм.

Тос хадгалах чадамж

Казейны тос хадгалах чадамж нь модификацийн дараа ихээхэн өссөн юм. Хамгийн ихээр өссөн явдал IM-трипсины үйлчлэлээр үүссэн модификацийн үед ажиглагдсан болно. Гэвч өндөр модификацитай дээжүүдэд буюу ялангуяа T5-ийн үед тос хадгалах чадамж буурсан байна. Энэхүү дээжин дээр буюу T5 дээр бид C18 HPLC ашиглан их хэмжээний пептидүүдийг илрүүлсэн гэдгийг санах хэрэгтэй юм.

Розим-41-ээр казейныг үйлчлүүлсэн нь тос хадгалах чадамжид хамгийн багаар нөлөөлсөн болно. Гэхдээ EAIADJ  дахь тос хадгалах чадамжийн өсөлт нь хамгийн өндөр нь байсан юм.

Дулаан тэсвэрлэх чадамж

Сайн функциональ шинж чанартайгаас гадна дулаанд тэсвэртэй казейн нь хүнсний үйлдвэрт маш тохиромжтой юм. Бэхжүүлсэн трипсин, химотрипсин, РОзим-41 зэргийн үйлчлэлээр модификаци хийсний эцэст халаасан дээж нь халаагаагүй дээжтэйгээ адил цэвэр байсан юм.

Дулааны үйлчлэлийн дараа дээжинд бохирдол, тунадасжилт ихэсдэг билээ. Харин ферментийн үйлчлэлийн дараа дулаанд тэсвэртэй байдал хамгийн бага модификацитай үед ч сайжирсан байна. Энэ нь гидролизын дүнд модификаци/харилцан үйлчлэл явагдаж коагуляци, тунадасжилтыг багасгасан болохыг харуулж байгаа юм.

Дулаанд тэсвэртэй байдлын ихсэлт нь уураг-уураг, уураг-пептидийн холбоо ихэссэнтэй ч холбоотой байж болох юм. C8 HPLC-ийн үед дээрх маягийн холбоо үүссэн болохыг тогтоожээ.

Уургууд нь гидрофоб гадаргуутай байх нь элбэг байдаг тул уургийг бүрхэн усан бүтэц үүсдэг. Температур ихсэхэд энэхүү ‘iceberg’ бүтэц нь задарч, уургийн гидрофоб гадаргуу хумигдаж дотогш орох, эсвэл өөр лигандуудтай холбогдож гидрокарбон-усан гадаргууг багасган чөлөөт энергийг багасгадаг байна. Энэ байдал нь BSA тосны хүчлүүдтэй лиганд үүсгэснээр дулаанд тэсвэртэй байдлаа ихэсгэдэг шиг уургийн дулаанд тэсвэртэй байдлыг ихэсгэж байж болох юм.

Өмнөх судалгаандаа бид α-s1-казейны өөр өөр жинтэй тосны хүчлүүдтэй нэгдэх замаар гидрофоб шинж чанараа ихэсгэж байсныг ажигласан билээ. Энэ тохиолдолд мөн казейн хоёрдогч болон гуравдагч бүтцээ хадгалсаар байсан юм. Тиймээс молеукл хоорондын холбоо, хэлбэр молекулын функциональ шинж чанарт ихээхэн нөлөөлдөг болохыг харуулж байгаа юм.

Гадаргуугийн гидрофоб шинж чанар ихсэх нь гидрофоб холбоо үүсэх магадлалыг ихэсгэдэг. Энэхүү холбоо үүсэх магадлал ихсэх тусам эмульсжүүлэх чанар, тогтвортой чанар, хөөсрөх чанар зэрэг нь хамгийн сайн байдаг. α-s1-казейнаас цэвэршүүлж гарган авсан пептидийн хувьд үүнтэй адил үр дүн гарч байсан.

Эцэст нь дүгнэж хэлэхэд казейныг субстрат болгон трипсин, химотрипсин, Розим-41 хэмээх ферментүүдийг бэхжүүлэн хэрэглэж функциональ пептидүүдийн тасралтгүй үйлдвэрлэлтийг хийх нь бүрэн боломжтой юм. Уусах чанар, EAI, тогтвортой байдал, тос хадгалах чадамж, дулаанд тэсвэртэй байдлийг сайжруулахад бага хэмжээний модификаци ч хангалттай болохыг дээрх судалгаа харуулж байна.

Уг судалгааны ажлын эх: Casein hydrolysate. II. Functional properties of peptides, Zahur U. Haque, Zahid Mozaffar
Food Science and Technology, Southeast Dairy Foods Research Center, MAFES, Mississippi State University, MS 39762, USA 

Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s