Agaricus blazei-ийн өсгөвөрлөсөн үрт биеэс хавдрын эсрэг үйлчлэлтэй β-глюканыг ялгах

A. blazei нь японд өргөн хэрэглэгддэг эмчилгээний өндөр ач холбогдолтой мөөг юм.  Өсгөвөрлөсөн A. blazei-аас полисахаридын хэсгийг халуун ус (AgHWE), хүйтэн NaOH (AgCA), халуун NaOH (AgHA)-аар давтсан хандлалтаар бэлтгэдэг. Химийн, энзимийн болон NMR анализаар AgHWE, AgCA, AgHA-ийн анхдагч бүтэц нь голчлон 1,6-β-глюканаас бүрддэгийг харуулж байна. Эдгээр хэсгүүд дотоос NaOH-н ханд нь ICR хулганд sarcoma-180 ийн хатуу хэлбэрт хавдрын эсрэг үйлчлэл үзүүлдэг. Эдгээр хэсгүүдийн идэвхитэй бүрдэлийг тодорхойлохын тулд хэд хэдэн химийн болон энзимийн үйлчлэлийг хэрэглэсэн болно.

Эдгээр хэсгүүд нь 1-рт DEAE-Sephadex A-25-р гүйж өнгөрсөн саармаг β-глюкан, 2-рт периодатын исэлдэлт (I/B), хүчлийн хагас гидролизод (I/B/H) тэсвэртэй, 3-рт I/B-ийн өмнө 1,3-β-глюконаза, зимолазад тэсвэртэй байсан ч I/B/H-ийн дараа мэдрэг болсон.  Мөн I/B/H-ийн үйлчлэлийн дараа AgCAE-ийн саармаг хэсгийн хувьд 1,3-β-глюкозидын холбоог илэрхийлдэг 86ppm-ийн ойролцоох сигнал нь C-NMR спектрт тодорхой илэрсэн байна. Эдгээр баримтууд нь олон салаалсан 1,3-β-глюканы сегмент нь хавдрын эсрэг идэвхийн гол төвийг үүсгэдгийг харуулж байгаа юм.

Арга зүй

Полисахаридын фракцийг бэлтгэх

A. blazei –аас полисахаридын хэсгийг нэрмэл ус, хүйтэн NaOH, халуун NaOH болон HCI-р олон дахин хандлан бэлтгэнэ. Өөрөөр хэлбэл агаарт хатааж нунтагласан A. blazei (25-50гр)-г халуун усанд хандална (2ц 1210С). Хандаас полисахаридын хэсгийг 4 эзэлхүүн EtOH(AgHWE-1)-р тундасжуулж бэлтгэнэ. Үлдэгдлийг дахин халуун усаар хандлаад дээр тодорхойлсны дагуу хандаа бэлтгэнэ (AgHWE-2, AgHWE-3). Үлдэгдлээ халуун шүлт (10% NaOH/5% мочевин, 4°C, 1 өдөр, хоёр удаа, AgCA-1, AgCA-2), хүйтэн шүлтээр (10% NaOH/5% мочевин, 65°C, 1 цаг,  AgHА-1) хандлана. Өргөн диализын дараа полисахаридын фракцуудаа шүлтийн хандуудаас цуглуулж авна. Гол бүрэлдэхүүнээ хандалж авахын тулд NaClO-р үйлчлүүлнэ. Үр дүнд гарсан хандыг өргөн диализд оруулна (AgPPS). Үлдэгдлээ ч мөн адил диализд оруулна (AgPPR). Полисахаридын фракцын 5% орчмыг NaClO-р үйлчлүүлэх замаар уусгана.

Сүүлчийн хандлалтын шатны дараа нийт бүрэлдэхүүн хэсгийн 15%-с ихгүй хэсэг нь үлдэнэ. Энэхүү хэсгүүдийн уураг болон нүүрсусыг фенол хүхрийн хүчлийн аргаар глюкозтой харьцуулж, BCA аргаар үхрийн ийлдэсний альбуминтай харьцуулан тус тус хэмждэг.   Ханд нь үндсэндээ нүүрс уснаас бүрддэг ба анионик бодисуудыг ихээр агуулдаг. Диализын дараа NaOH-ийн ханд нь сүүн уусмал болдог.

Тиймээс зарим туршилтуудад усанд уусдаг хэсэг (AgCAS, AgHAS) ба усанд уусдаггүй хэсгийг (AgCAR, AgHAR) гаргаж авахын тулд хийдэг этанолын тундасжуулалтын өмнө уусмалаа центрифугддэг.

Том хэсгүүдийн бүрдэл сахаруудыг альдитол ацетатын үлдэгдэлээр анализ хийдэг. Усанд уусдаг хэсгийн үндсэн бүрдэл сахар нь глюкоз байсан. Үүний эсэргээр усанд уусдаггүй хэсэгт нь  (AgCAR, AgHAR) глюкозоос гадна ксилоз, манноз, глактоз, ихээр агуулагдаж байсан. Маш жоохон хавдрын эсрэг үйлчлэлээс нь болоод зөвхөн усанд уусдаг хэсгийг нь илүү нарийн анализад оруулдаг.

Полисахаридийн фракцийн шинж чанар

Полисахаридын фракцийн нүүрстөрөгч 13 NMR спектрийг үзүүлжээ. Спектрийг урд нь хэвлэгдсэн спектруудтай харьцуулан дүгнэсэн байна. 103ppm-ийн үе дэх аномерик нүүрстөрөгчийн сигнал β-хэлбэр маягаар тодорхойлогддог.  Полисахаридын фракцийн спектр дунд AgHWE3 ба  AgHA нь тод сигналыг үзүүлдэг. Эдгээр фракцууд нь спектр дээр зөвхөн 6-н үндсэн сигналыг үзүүлдэг нь 1,6-β глюкозидын холбоотой хамааралтай байдаг. Бусад фракцийн үндсэн сигналууд нь эдгээр 6 сигналуудад оролцдог. AgHWE1 ба AgCA1 100ppm-ийн орчимд сигнал үзүүлдэг нь α-глюкантай холбоотой. 88ppm-н 1,3-β холбоотой сигнал нь сайн илрээгүй байна. Эдгээр баритууд нь A. blazei –ийн үндсэн полисахаридын бүрдэл хэсэг нь 1,6-β глюкан гэдгийг нотлож байна.

Эдгээр фракцийн хавдрын эсрэг үйлчлэлийг ICR хулгануудад Sarcoma180-ийн хатуу хэлбэрээр шалгаж байсан. Халуун устай ханд болон NaCIO-ийн ханд үйлчлэл үзүүлэхгүй байхад NaOH-ын ханд нь үйлчлэл үзүүлж байна. Оптимум дозыг харьцуулж үзэхэд хүчтэй үйлчлэл нь зөвхөн их хэмжээний дозын (2000µg/хулгана×5) хэрэглээний үед ажиглагдаж байна. Заалт полисахаридтай харьцуулахад sonifilan нь 20 дахин бага идэвхитэй байжээ. AgHWE олон дахин хэрэглээний үед сүүлчийн хэрэглээ нь идэвхжлийг үзүүлж байна. Бид урьд нь олон төрлийн полисахаридын хавдрын эсрэг идэвхжлийг судалсан бөгөөд Penicillium islandicum-ийн 1,6-β-глюкан, изландикан нь Sarcoma180-ийн хатуу хэлбэрт хавдрын эсрэг үйлчлэл үзүүлэхгүй байгааг нь тогтоожээ. NaOH- ын ханд зөвхөн хавдрын эсрэг сайн үйлчлэл яагаад үзүүлж байгааг ойлгоход хэцүү ч HWE-ийн ба NaOH-ын хандны аль аль нь 1,6-β-глюкозидын холбоог агуулж байдаг ба эдгээр фракцийн дундаж молекул жин нь ойролцоо байдаг юм. NaOH-ын ханд ба sonifilan-ний харьцангуй идэвхжлийг авч үзхэд идэвхитэй материалын агууламж нь 5%-с бага ба NMR спекрт илрэхгүй байж болох юм. Limulus G-тест нь 1,3-β глюканыг тодорхойлход хэрэглэгддэг тул энэ ханднуудад ашигласан болно.

Ханднууд нь бүгд Limulus G-тесттэй урвалд орсон. Гэхдээ харьцангуй урвалд орсон хэмжээ нь бага байсан. Хэрэв G-тестийн урвалд оруулах чадвар нь 1,3-β-глюканаас хамаардаг бол G-тестийн урвалд оруулсан хэмжээний алдагдал нь 1,3-β-глюконаза, зимолиазагийн үйлчлэлтэй холбоотой байж болох юм. Эдгээрээс үзэхэд ханд дах идэвхитэй бүрдэл нь β-глюканы төвөгтэй холбоонууд юм.

NaOH-аас идэвхитэй бүрдэл хэсгийг нь цэвэрлэж авах

NaOH-ын ханд дахь идэвхитэй хэсгүүдийг олж тодорхойлхын тулд хандыг пракцлаж, химийн өөрчлөлтөнд оруулж идэвхжилийг нь шалгадаг. NaOH-ын ханд нь саармаг шингэн нөхцөлд усанд уусдаг болон уусдаггүй бодисыг агуулдаг. Усанд  уусдаг болон уусдаггүй хэсгүүдийг салгасны дараа усанд уусдаг хэсгээс идэвхжилийг сэргээдэг.  NAHCI-р үйлчилхэд уургийн үлдэгдэлүүд задарч элемент анализ хийхэд азотын агууламж 0,51% хүртлээ буурдаг ч идэвхжил бусад β-глюкантай адил хэвээрээ үлддэг байна. DEAE Sephadex A-25 хроматографаар идэвхжилийг дахин сэргээдэг. Зимолиазагаар үйлчилхэд ихэвчлэн идэвхитэй байдал нь хэвээрээ хадгалагддэг. Периодатын исэлдэлт, борогидритийн ангижруулалт, хагас хүчлийн гидролизийн дараа идэвхжил мөн хэвээрээ үлддэг.

Эдгээр баримтууд нь идэвхитэй бодис нь уураг биш   β-глюкан юм гэдгийг нотлож байна. Идэвхитэй бодисыг илүү нарийн судлахын тулд NaOH-ын хандыг их хэмжээгээр фракцалдаг. AgCA-г NaOH-д уусгаж дараа нь саармагжуулж уусанд уусдаг хэсгийг нь цуглуулж авна.  Диализийн дараа хадгалагч бодис (retaintate)-ийг DEAE Sephadex A-25 баганад оруулж өгдөг. Гүйж өнгөрсөн хэсгийг (AgCADP) натрийн метапериодатаар исэлдүүлж, диализид оруулж, боргидридээр ангижруулдаг (AgCADPIB). AgCADPIB-ийг 0,1н TFA-д уусгаж тасалгааны темпратурт шөнөжин хагас гидролизид оруулдаг. Үүссэн хэсгийг MWCO 3500 болон MWCO 1000 диализын мембранаар нэрмэл усны харгалзуулан диализид оруулна. Хадгалагч бодис (MWCO 3500 NDF) нь AgCADPIBH гэж тодохойлогдож байна. MWCO 3500 NDF: MWCO 1000 NDF: MWCO 1000 DF харьцаа нь 13:1:3 байв.

AgCADP-ийн хувьд 86ppm-н ойролцоох 1,3-β-глюкозидын холбоог илтгэх сигналын эрчим нь өссөн байна. AgCADP нь 100ppm-ийн ойролцоо α-глюканыг илтгэх жижиг сигналуудыг өгч байжээ. Тиймээс 50% этанол нь тундасжуулалтыг гүйцэтгэдэг. Үйлчлэлийн дараа усанд уусдаг хэсгээс α-глюканыг сонгомолоор сэргээж авдаг ба тундасжсан бодис нь  β-глюканаар баяжсан байдаг. Эдгээр баримтууд нь α болон β глюкан нь хоорондоо ямар нэг холбоогүй гэдгийг харуулжээ. 6-р зурэгт периодатын исэлдэлтийн бүтээгдэхүүнүүдийн спектрийг үзүүлжээ. 86ppm-н ойролцоох сигнал нь  AgCADPIВ ба AgCADPIBH-ийн спектрт илүү тод илэрсэн байна. Энэ нь A. blazei-ний NaOH-ын ханданд 1,3-β-глюкозидын холбоо ихээр агуулагддагыг харуулжээ. 1,3-β-глюкозидын холбоог илүү нарийн судлахын тулд химийн хувьд өөрчлөлт оруулсан хэсгүүдийг зимолиазагаар үйлчлүүлдэг. Үүссэн хэсгүүдэд Toypearl HW 65-г ашиглан гельфилтрацийг хроматографийг хэрэглэдэг.  AgCADPIBH-ийн дундаж молекул жин нь зимолиазагийн үйлчлэлээр нилээн багассан байна. Эдгээр нь A. blazei-ийн ханд дахь 1,3-β-глюкан нь ихээр салаалсан байдаг бөгөөд зимолиазагийн үйлчлэлд тэсвэртэй байдаг.

Салаалсан 1,3-β холбоо нь иммунохимийн аргаар судлагдсан байна. Бид урьд нь грифолан (anti-GRN) хэмээх 6-салаалсан 1,3-β-глюканий эсрэг ийлдэсийг гаргаж авсан. Бид AgCA-ийн урвалд орох чадварыг  anti-GRN-ний эхаргалзуулан шалгаж үзсэн. Хэд хэдэн полисахаридыг ELISA-ийн тавган дээр адсорбцолсон бөгөөд урвалд орох идэвхийг нь дараалан шингэлсэн anti-GRN- ийн харгалзуулан шалгасан. AgCA-1 нь anti-GRN тэй хүчтэйгээр урвалд орж байсан байна. Эдгээр баримт нь A. blazei  нь бага ч гэсэн ач холбогдолтой хэмжээний 1,3-β-глюкозидийн сегмент агуулж байдгийг баталж байна.

Advertisements

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s