Ираны цагаан идээний дээжнээс гаргаж авсан Lactobacillus RN78 омгийн плазмидтай холбоотой лактоцин RN78-ийн ялгарал

Бяслагний дээжээс ялгаж авсан Lactobacillus RN 78-ийн ялгаж авдаг лактоцин RN 78 нь Kl. pmeumoniae, L. ivanovii, L. monocytogenes, Ps. аeruginosa, S. aureus зэрэг Грам эерэг болон сөрөг бактериудын эсрэг үйлчлэл үзүүлдэг болох нь нотлогджээ. Энэ бактериоцин нь дулаанд тэсвэртэй (100°С-д 90, 121°Ё-д 15 минут тэсвэртэй байна), рН-ийн 3-9 утганд тогтвортой байдлаа хадгалж чаддаг юм. Гэвч протеолитик ферментүүд болох проназа, трипсин зэргээр үйлчилсэний дараа бактерийн эсрэг үйлчлэл алга болж байхад каталаза ферментийн үйлчлэлийн дараа ямар ч нөлөөлөл ажиглагдахгүй байлаа.

Уг бактериоциныг 10240 AU/мл хэмжээтэйгээр авч индикатор эс болох L.monocytogenes-ийн 106-107 хэмжээний эсийн эсрэг үйлчлүүлэхэд эсийн тоо огцом цөөрсөн билээ. Лактоцин RN 78 дээр 0.5 мМ EDTA нэмж өгөхөд урьд нь үйлчлэл үзүүлдэггүй байсан E. Coli, S. typhi зэргийн эсрэг устгах үйлчлэлийг явуулж эхэлжээ.

Бактериоцин идэвхтэй ялгаруулагч омгийг Акридин оранжаар үйлчлүүлэхэд bac-мутант хэмээх идэвхгүй бактериоцин үүсгэгч омог бий болжээ. Энэ хоёр омгийг хооронд нь харьцуулж үзэхэд зэрлэг омогт байх 42 kb плазмид bac-мутантад байхгүй байгаа нь тогтоогджээ. Плазмидыг нөхөж өгсөнөөр мутантууд нь идэвхтэй бактериоцин ялгаруулж эхэлсэн нь бактериоцины бүтцийг кодлогч дархлааны ген цор ганц плазмид RN дээр биш бас хромосом дээр байдаг болохыг харуулж байгаа юм.

Оршил

Бактериоцин гэдэг нь нарийн спектртэй антибиотикууд юм. Энэ нь хөрөнгөний мөөг, шаахай зэргийг устгах зориулалттай бодисуудтай аналог юм. Бактериоциныг 1925 онд Ав Грациа нээсэн юм. Түүний бактериоцины нээлт нь цаашид антибиотикийг гаргаж авах, бактериофагийг нээх нээлтүүдэд нөлөөлсөн гэж үздэг. Тэрээр өөрийнхөө нээлтийг E.coli-ийн эсрэг үйлчилдэг учраас колицин гэж нэрлэжээ.

Сүүн хүчлийн бактериуд нь өөртэй ойрын холбоотой бусад сүүн хүчлийн бактериуд болон өвчин үүсгэгч Грам эерэг бактериуд болох B. cereus, Cl. perfringens, S. aureus, L. monocytogenes зэргийн эсрэг устгах үйлчлэл үзүүлдэг юм. Lactococcus lactis-ийн ялгаруулдаг ганц бактериоцин болох низины цэвэршүүлсэн хэлбэрийг дэлхийн 45 оронд хүнсний бүтээгдэхүүнүүдэд хэрэглэж байна.

Хүнсэнд хэрэглэгдэхэд зөвшөөрөгдсөн низин болон педиоцинууд нь дулаанд тэсвэртэй, үйлчлэлийн маш өргөн спектртэйгээрээ онцлог юм. Эдгээр нь мөн удаан хугацааны турш хөлдөөсөн байдалд идэвхээ хадгалж чаддаг юм. Бусад сүүн хүчлийн бактериас ялгаж авсан бактериоцинууд гэвэл Lactococcus lactis subsp. lactis 484-ийн лактокоццин, Lactobacillus acidophilus TK8912-ийн ацидоцин 8912, Lactobacillus gasseri LA39 гассерицин А, Lactobacillus plantarum NRIC 149-ийн плантарицин-149 зэргийг одоогийн байдлаар тодорхойлж, цэвэршүүлээд байна.

Материал ба арга

Бактерийн омог ба тэжээлийн орчин

Бяслагны дээжээс ялгаж авсан Lactobacillus-ийн омог нь бактериоцин ялгаруулагч омог юм. Энэ омгийг MRS шөлөнд 24 цаг 37°С-д ургуулдаг бол бусад Грам эерэг болон сөрөг бактериудыг 37°С-д тэжээлийн шөл (Merck) болон тархи-зүрхний шөлөнд ургуулдаг.

Бактериоцины биошинжилгээ ба хязгаарлалтын спектр

Бактериоцины хяналтыг Schillinger нарын гаргаж ирсэн агарын нүхээр диффузлэх аргаар гүйцэтгэнэ. Грам эерэг ба Грам сөрөг мэдрэг эсүүдийн эсрэг үйлчлэл үзүүлэх хамгийн бага концентрацийг тодорхойлоход Mayr-Hartings-ийн аргыг хэрэглэсэн болно. 10­6-107 тоотой индикатор эс агуулсан шингэн агарыг хатуу агартай аяган дээр хийж 37°С-д 18-24 цаг өсгөвөрлөсний эцэст хязгаарлалтын зон гарч ирсэн эсэхийг шалгана.

Нэг дурын нэгж (AU) нь хамгийн өндөр хоёр дахин шингэрүүлэг хийсэн үеийн индикатор омогт үзүүлсэн хаязгаарлалттай тэнцүү бөгөөд AU/мл-ээр хэмжинэ.

Бактериоцины ялгаралтыг тогтоохын тулд хамгийн энгийн арга болох хэд хэдэн агарт тэжээлийн орчинд үүсгэгч омгийн өсгөврөө тариад 30°С-д 24 цаг тариад дараа нь бүгдийг давхарлаад 30°С-д дахин 24 цаг инкубацлана.

Үүний дараа хязгаарлалтын зон гарсан эсэхийг шалгаж бактериоцин ялгарсан эсэхийг тогтооно. Энэ нь хамгийн хялбар арга бөгөөд бактериоциныг бактериофагтай андуурах нь байдаг. Илүү нарийн аргууд гэвэл хэт ягаан туяагаар үйлчлэх, митоцин С, дулааны шок зэрэг аргууд байдаг. Хэт ягаан туяагаар үйлчлэх, митоцин С гэсэн аргууд нь ДНХ-ийн эвдрэл гаргаж SOS хариу урвалыг идэвхжүүлдэг.

Тунадасжуулалт (аммоний сульфат), цэвэршүүлэлт нь лизогеник, литик фагуудыг шөлнөөс зайлуулахад тусалдаг.

Фермент, рН, детергент, дулааны үйлчлэл

Лактоцин RN78-ыг тодорхойлохын тулд олон төрлийн физик химийн хүчин зүйлээр үйлчлүүлж үзэх хэрэгтэй. Бактериоцин үүсгэгч омгийг 37°С-д 24 цаг өсгөвөрлөөд дараа нь центрифугээр (4°С-д 10 минут 10000 эрг/мин) нь эсүүдийг ялгана. Ийнхүү эсгүй тэжээлийн шингэнийг бэлдээд рН-г нь 6 болгон тохируулна. 1 мл дээжийг 3 удаа аваад тус бүрийг 1 мг/мл концентрацитай трипсин, проназа Е, каталазатай хамт 2 цаг инкубацлаад тус бүрийн бактерийн эсрэг идэвхийг шалгана.

Бактериоцин дээр рН хэрхэн нөлөөлж байгааг шалгахдаа эсгүй тэжээлийн шингэний рН-ийг 1М HClA болон 4М NaOH-г ашиглан рН-г 3-12 болгодог. 37°С-д 24 цаг өсгөвөрлөсний эцэст бүх дээжүүдийн бактерийн эсрэг идэвхийг нь шалгадаг.

Лактоцин RN 78-н дулаанд тэсвэртэй байдлыг шалгахдаа тэжээлийн шингэнийг 80, 100, 121°С-д тус тус буцалгана. 10 минут болгонд бактериоцины идэвхийг шалгана. Натрийн додецил сульфат (SDS), Tween 20, Tween 80-г гурван дээжинд нь тусад нь нэмж өгснөөр сурфактантын нөлөөллийг шалгаж болдог. EDTA-г мөн эцсийн концентрацийг 0.5мМ болгохын тулд нэмдэг. Бүх дээжийг 37°С-д 4-6 цаг өсгөвөрлөөд дараа нь идэвхийг шалгадаг.

Хадгалалтын үеийн бактериоцины тогтвортой байдал

Лактоцин RN 78-г жижиг хуруу шилэнд удаан хугацааны турш -20, 4, 37°С-д тус тус хадгалаад сар болгон бактерийн эсрэг идэвхийг нь шалгана.

Плазмидыг тогтоох

Lactobacillus RN 78-ийн мутант нь идэвхгүй бактериоциныг үүсгэдэг. Акридин оранжыг 5-150µг/мл гэсэн эцсийн концентрацитайгаар үүнд ашигладаг. Эхлээд бүх колонийг авч үзэхдээ бактерийн эсрэг идэвхийг шалгасан байна. Хязгаарлалтын зон ажиглагдаагүй колонийг Bac-мутант гэж үзэн плазмид байгаа эсэхийг шалгана.

Зэрлэг омог дахь плазмидын байгааг, мутант дээрх плазмид байхгүй байгааг Echardt-ийн гель электрофорезоор анализ хийж мэдэж болно.  Тест омгийн (100-500µл) эсүүдийг центрифугээр ялгаж аваад хүйтэн TNE буфферээр угаана. 0.9%-ийн агарын гель дээр гаргасан нүхэнд 100µл TNE буфферт түр байлгасан эсийг нүхнүүдэд тарьж өгнө. 50µл лизисын уусмалыг нэмээд болгоомжтойхон хутгаж өгнө. Гелийг 30 Вольтоор 30 минут гүйлгээд 120 Вольтоор 3 цаг гүйлгэнэ.

 Үр дүн ба хэлэлцүүлэг

Лактоцин RN 78 нь хоолны хордлого үүсгэгч гол организм болох L. monocytogenes-ийн эсрэг үйлчлэл үзүүлдэгээрээ онцлог юм. Үүнээс гадна бактериоцин М46, низин, мезентерицин Y105, курвацин А, карнозин, энтероцин 1146, сакацин Р, писциколин 126 зэрэг нь тухайн организмын эсрэг үйлчлэл үзүүлдэг юм.

Ихэнх сүүн хүчлийн ялгаруулдаг бактериоцинууд нь Грам сөрөг бактериудын эсрэг үйлчлэл үзүүлдэггүй билээ. Гэвч үүнтэй эсрэгцэн лактоцин RN 78 нь Kl. Pneumoniaea, Ps. Aeruginosa зэргийн эсрэг хүчтэй үйлчлэлтэй нь нотлогдсон юм. Үүгээр ч зогсохгүй энэхүү Грам сөрөг бактерийн эсрэг үйлчлэл нь EDTA, Tween 20, Tween 80, Triton X100, SDS мэтийн детергентүүдийг нэмсэн даруйд улам идэвх нь ихсэж байгаа нь гайхалтай юм. 0.5 мМ EDTA-г лактоцин RN 78 дээр нэмэхэд урьд өмнө нь үйлчилдэггүй байсан E. Coli, Salmonella typhi зэргийн эсрэг үйлчилж эхэлсэн нь тухайн бактериоцины үйлчлэлийн спектр детергентийн нөлөөгөөр өргөсдөг болохыг харуулж байна.

Энэ нь детергент нэмэхэд бактериоцины молекулыг олон жижиг хэсэг болгон задалдагтай холбоотой байж болох юм. Энэхүү олон жижиг хэсгүүд нь илүү эсийн гүн рүү нэвтрэн устгах чадлаар сайжрах нөхцөл болдог байж болох юм. Энэ нь бусад урьд өмнө хийгдсэн хэд хэдэн судалгаатай таарж байгаа юм. Гэвч том молекулт бактериоциныг детергентээр жижиг хэсгүүд болгон задлахад идэвх нь суларсан судалгааны ажлууд ч мөн байна.

RN 78-ын бий болгосон антагонистик бодис нь протеолитик ферментүүдийн үйлчлэлээр бүрэн идэвхгүйжсэн байна. Энэ нь лактоцин RN 78-ийн уурагт бүтэцтэй болохыг баталж байгаа бөгөөд каталазагийн үйлчлэлээр уг бактериоцины идэвх алдагдахгүй байгаа нь устөрөгчийн пероксид идэвхтэй хэсэгт хамаарагддагүйг харуулж байгаа юм.

Энэ бактериоцины нэг онцлог шинж нь 100°С-д 1 цаг, автоклавийн 121°С-д идэвхээ хадгалж чаддаг явдал юм. Энэхүү дулаанд тэсвэртэй чанар нь энэхүү бактериоцины нарийн уурагт бүтэцтэй холбоотой байж болох юм. Энэ нь мөн рН 3-10-ийг тэсвэрлэж чаддаг ба рН-ийн утга 5-7 байх үед хамгийн өндөр идэвхийг үзүүлдэг.

Эрчимтэй олширч буй мэдрэг эсийн колони дээр дээрх бактериоциныг нэмэхэд эсийн тоо эрс цөөрдөг байна. 106-107 хэмжээний индикатор эс L. monocytogenes дээр 10240 AU/мл лактоцин RN 78-г нэмэхэд 2 цагийн дараа бүх эсийн 99.9% устсан байв. Бактериоцины концентрацийг ихэсгэж 12840 AU/мл болгоход цагийн дотор 106 тоотой эсээс нэг эс үлдсэн байна.

Лактоцин RN 78 нь 5%-ийн глицеролтой тосгүйжүүлсэн сүүнд -20°С-д байлгахад тэсвэртэй байдаг нь батлагдав. 4°С-д нэг сар, 37°С-д нэг жил энэхүү бактериоцин нь тогтвортой шинж чанараа хадгалдаг. Бактериоцины бүтцийг кодлодог генүүд хромосом болон плазмидын аль алин дээр оршдог байна.

Хэдийгээр 42 kb плазмид зэрлэг омгуудад байгаа нь батлагдсан ч bac-мутант буюу алдаатай, идэвхгүй бактериоцин ялгаруулагчид нь мөн плазмидыг агуулдаг байна. Үүнээс харахад лактоцин RN 78-ийг кодлох дархлааны ген нь плазмидаас гадуур хромосом дээр байрладаг ажээ.

Дүгнэлт

Бактериоцинууд нь хүний биеийн хэвийн микрофлор болдог өвчин үүсгэдэггүй бактериоцинуудаар үүсгэгддэг билээ. Антибиотикийн зохисгүй хэрэглээгээр эдгээр бактерийг устгасан тохиолдолд өвчин үүсгэгч бактериуд олширч эхэлдэг байна.

Бактериоцинууд нь мөн хорт хавдрын оношлолт, эмчилгээнд үр дүнгээ өгөж болох талаар судалгаа хийгдэж байгаа бөгөөд туршилтын шатандаа явж байгаа юм. Гэвч бактерийн эсрэг үйлчлэлтэй эдгээр бодис нь хөхтөн амьтны хавдрын эсийн эсрэг ямар үйлчлэл үзүүлэх тал дээр маргаан дэгдсээр байгаа юм. Бактериоциныг мөн ДОХ-ын эсрэг эмийн зориулалтаар туршилт явагдаж байна.

Лактоцин RN 78-г хоол хүнсний хадгалалтын тал дээр ашиглах нь маш үр дүнтэй бөгөөд хуурай ферментат дээр нэмэлт нунтаг байдлаар хэрэглэж болох юм. Энэ нь мөн физиологийн рН-д тэсвэртэй байгаа нь анагаах ухаанд хэрэглэж болох үүдийг нээж байгаа юм. Энэ нь хоол хүнсийг муудахаас хамгаалдаг химийн гаралтай бүтээгдэхүүнүүд болох сорбик хүчил, хүхрийн диоксид, нитрит зэргийг орлож болох юм. Үүнийг мөн мал эмнэлэг, эмийн үйлдвэрлэлтэд ашиглах бүрэн боломжтой.

Уг орчуулгын эх нь болсон судалгааны ажил:

PLASMID-ASSOCIATED LACTOCIN RN78 PRODUCTION IN A LACTOBACILLUS RN78 STRAIN ISOLATED FROM A DAIRY SAMPLE IN IRAN by Naheed Mojgani, M.P. Ashtiani, Saeid A. Khanian

Advertisements

One thought on “Ираны цагаан идээний дээжнээс гаргаж авсан Lactobacillus RN78 омгийн плазмидтай холбоотой лактоцин RN78-ийн ялгарал

Хариулт үлдээх

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Өөрчлөх )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Өөрчлөх )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Өөрчлөх )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Өөрчлөх )

Connecting to %s